本文關(guān)鍵詞：沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白通過上調(diào)DJ-1蛋白表達(dá)激活ERK信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)能通過抑制宿主細(xì)胞凋亡以逃避宿主的免疫清除,但其抗凋亡機(jī)制并未完全闡明。本研究試圖探討Ct質(zhì)粒蛋白pORF5與ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和互作宿主蛋白DJ-1三者之間的關(guān)系以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,為闡明Ct致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:用腫瘤壞死因子(TNF-α,20ng/ml)和放線菌酮(CHX,2μg/ml)誘導(dǎo)pORF5基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞(pORF5-HeLa)和空質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對(duì)照HeLa細(xì)胞(GFP-HeLa)凋亡6h,利用Hoechst33342染色檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡情況,實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分別檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;用ERK1/2特異性抑制劑PD98059(30μM/ml)預(yù)處理pORF5-HeLa細(xì)胞30min后,再用凋亡誘導(dǎo)劑(TNF-α/CHX)刺激ERK抑制劑處理組pORF5-HeLa細(xì)胞(PD98059/pORF5-HeLa)和未加抑制劑組pORF5-HeLa細(xì)胞6h,利用Hoechst33342,TUNEL染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡率,采用qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)Bax、Caspase-3、Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;將sh-RNA-DJ-1病毒液感染pORF5-He La細(xì)胞,建立穩(wěn)定干擾DJ-1表達(dá)的pORF5-HeLa細(xì)胞系及空白載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞系;凋亡處理6h后,利用Hoechst33342,TUNEL染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)穩(wěn)定干擾DJ-1的pORF5細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率,qRT-PCR,Western blot檢測(cè)Bax、Caspase-3和Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平;用凋亡誘導(dǎo)劑(TNF-α/CHX)刺激經(jīng)PD98059預(yù)處理的pORF5-HeLa細(xì)胞和未處理組細(xì)胞6h,Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞的DJ-1蛋白表達(dá);用凋亡誘導(dǎo)劑(TNF-α/CHX)刺激穩(wěn)定干擾DJ-1表達(dá)的pORF5-HeLa細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞6h,Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞的ERK1/2磷酸化水平。結(jié)果:1、hoechst染色結(jié)果顯示,對(duì)照組gfp-hela細(xì)胞出現(xiàn)較多固縮,碎裂,亮藍(lán)濃染核,而porf5-hela細(xì)胞核染色呈均勻,彌散熒光,porf5-hela細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組下降32.4%(p0.05);porf5-hela細(xì)胞中bax和caspase-3的mrna水平較對(duì)照組分別下降5.6倍(p0.01)和18.6倍(p0.01);porf5-hela細(xì)胞中bax的蛋白水平較對(duì)照組下降78.2%(p0.01),而bcl-2較對(duì)照上升167.8%(p0.01)。2、hoechst和tunel染色結(jié)果顯示,erk抑制劑處理組porf5-hela細(xì)胞的凋亡率較未處理組升高了28.5%(p0.05),erk抑制劑處理組tunel陽性細(xì)胞百分率為(54.6±2.1)%,未處理組陽性細(xì)胞百分率為(12.5±3.4)%,erk抑制劑處理組的tunel陽性細(xì)胞百分率較未處理組升高了42.1%(p0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,erk抑制劑處理組的porf5-hela細(xì)胞的凋亡率較未處理組增加12.57%;erk抑制劑處理組的porf5-hela中bax和caspase-3的mrna水平分別較未處理組升高2.5倍(p0.01)和302.7倍(p0.01);wb結(jié)果顯示,erk抑制劑處理組的porf5-hela中bax蛋白水平較未處理組升高264.3%(p0.01),bcl-2蛋白水平較未處理組降低86.6%(p0.01)。3、hoechst和tunel染色結(jié)果顯示,shdj-1-porf5-hela細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組增加30.8%(p0.05),shdj-1-porf5-hela細(xì)胞中tunel陽性細(xì)胞百分率為(45.2±2.3)%,未干擾組僅為(8.3±2.0)%,dj-1穩(wěn)定干擾組的tunel陽性細(xì)胞百分率較對(duì)照組升高了36.9%(p0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:shdj-1-porf5-hela細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組上升了17.05%;shdj-1-porf5-hela細(xì)胞中bax和caspase-3的mrna水平分別是對(duì)照組的187.8倍(p0.01)和3.6倍(p0.01);shdj-1-porf5-hela細(xì)胞中bax的蛋白水平較對(duì)照組升高387.5%(p0.01),bcl-2蛋白水平較對(duì)照組下降91.0%(p0.01)。4、erk抑制劑處理組的porf5-hela細(xì)胞中的dj-1蛋白表達(dá)水平與未處理組無差別(p0.05);shdj-1-porf5-hela細(xì)胞中的erk1/2磷酸化水平較對(duì)照組下降了102.8%(p0.05)。結(jié)論:1、沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白具有抵抗細(xì)胞凋亡作用。2、pORF5質(zhì)粒蛋白通過上調(diào)宿主蛋白DJ-1的表達(dá)激活ERK1/2信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：沙眼衣原體 pORF5質(zhì)粒蛋白 細(xì)胞凋亡 DJ-1 ERK1/2
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R374
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 第1章 緒論11-13
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料13-15
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器13
• 2.2 載體及細(xì)胞株13
• 2.3 主要試劑盒13-14
• 2.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑14
• 2.5 其他14-15
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法15-25
• 3.1 pORF5質(zhì)粒蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系15-20
• 3.2 ERK活性對(duì)p ORF5-He La穩(wěn)轉(zhuǎn)株凋亡的影響20-22
• 3.3 DJ-1 蛋白的表達(dá)對(duì)p ORF5穩(wěn)轉(zhuǎn)株凋亡的影響22-23
• 3.4 pORF5-He La細(xì)胞中ERK活性與DJ-1 蛋白表達(dá)的關(guān)系23-24
• 3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24-25
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-41
• 4.1 pORF5質(zhì)粒蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系25-28
• 4.2 抑制ERK1/2 的激活對(duì)pORF5-HeLa細(xì)胞凋亡的影響28-32
• 4.3 干擾DJ-1 蛋白的表達(dá)對(duì)pORF5-HeLa細(xì)胞凋亡的影響32-38
• 4.4 pORF5-He La細(xì)胞中ERK的激活與DJ-1 宿主蛋白表達(dá)升高的上下游關(guān)系38-41
• 第5章 討論41-45
• 第6章 結(jié)論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 綜述 γ 干擾素與自噬在抗沙眼衣原體感染中的作用51-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果59-61
• 致謝61

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本文編號(hào)：251313