【摘要】：目的：通過細胞生物學(xué)技術(shù),探討分離、培養(yǎng)、純化和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的方法,觀察滋補肝腎中藥六味地黃丸聯(lián)合堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞的作用,探索獲得較高比例神經(jīng)元樣細胞的誘導(dǎo)方法。 方法：采用全骨髓貼壁分離法分離、培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,以純化的BMSCs為研究對象,觀察細胞形態(tài)變化、生長增殖狀態(tài),MTT法檢測繪制細胞生長曲線,對第3代細胞進行表面標志物CD44、CD34免疫細胞化學(xué)染色法檢測,鑒定BMSCs。鑒定后,第3代細胞經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)24小時后按空白組、bFGF組、六味地黃丸組、bFGF+六味地黃丸組分別加入相應(yīng)誘導(dǎo)液進行誘導(dǎo),觀察細胞形態(tài)變化；誘導(dǎo)培養(yǎng)7天,采用免疫細胞化學(xué)染色法檢測相關(guān)標志物巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達。 結(jié)果：1.采用全骨髓貼壁分離法獲得原代BMSCs,隨多次換液棄懸浮細胞傳代棄其它貼壁細胞后得到純化的BMSCs.經(jīng)分離培養(yǎng)的第3代細胞增殖旺盛,具有較好的活力,利于誘導(dǎo)進行。免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示CD44呈陽性表達,CD34呈陰性表達。 2.生長良好的第3代BMSCs經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)24小時后與空白組相比,細胞數(shù)量增多,立體感增強；各組BMSCs分別以不同誘導(dǎo)液進行誘導(dǎo),2-3天細胞胞體收縮,形成圓形、不規(guī)整的錐形或三角形；4-5天,部分細胞逐漸伸出突起,多為2-3極,呈現(xiàn)較典型的神經(jīng)元樣細胞形態(tài)；6-7天,神經(jīng)元樣細胞數(shù)量增多,bFGF+六味地黃丸組更為明顯�？瞻捉M細胞形態(tài)1-3天未出現(xiàn)明顯改變,但生長速度明顯減慢,其后出現(xiàn)老化、死亡脫落。 3. bFGF組、六味地黃丸組和bFGF+六味地黃丸組均有Nestin、NSE、GFAP陽性表達,bFGF+六味地黃丸組各指標陽性率高于bFGF組、六味地黃丸組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：1.經(jīng)全骨髓貼壁分離法分離、培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞能逐漸純化,細胞活性較高、生物學(xué)性狀穩(wěn)定,適于做進一步研究。 2.六味地黃丸能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞定向分化,六味地黃丸和堿性成纖維細胞生長因子聯(lián)合誘導(dǎo)可獲得較高比例的神經(jīng)元樣細胞。
[Abstract]:Objective: To study the methods of separation, culture, purification and identification of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in rats by cell biology technique. BFGF was used to induce the differentiation of BMSCs into neuron-like cells in vitro, and to explore the induction method of high-scale neuron-like cells. Methods: BMSCs of SD rats were cultured by full-bone marrow adherent separation. BMSCs from SD rats were cultured. The morphological changes of cells, growth and proliferation of BMSCs were observed, and the growth curves of the cells were detected by MTT method. 4. CD34 immune cell chemical staining method for detection and identification of BMSC and s. after the identification, the third generation cell is pre-induced for 24 hours through the bFGF, and the corresponding inducing liquid is added into the blank group, the bFGF group, the six-flavor rehmannia pill group, the bFGF + Liuwei Dihuang pill group, and the change of the cell morphology is observed; and the induction culture 7 The expression of Nestin, neuron-specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) was detected by immunocytochemical staining. Dida. junction Fruit:1. The primary BMSCs were obtained by using the full-bone marrow adherent separation method, and the purified BM was obtained after the cells were discarded and the other adherent cells were discarded. SCs. The third generation of cells isolated and cultured has vigorous proliferation and has better activity and is beneficial to inducing The results showed that the positive expression of CD44 and the negative of CD34 were positive in the immunocytochemical staining. 2. In the third generation BMSCs with good growth, the number of cells increased and the three-dimensional effect was enhanced after 24 hours of pre-induction with bFGF. BMSCs were induced by different induction liquid, and the cell bodies of each group were contracted to form a circular, irregular cone or triangle. 4-5 days, some of the cells gradually protrude, most of which are 2-3 poles, presenting more typical neuron-like cell morphology;6-7 days, the number of neuron-like cells is increased, and bFGF + Liuwei Dihuang Wan The group was more obvious. The cell morphology of the blank group did not change significantly in 1-3 days, but the growth rate was significantly reduced, and then the aging was observed. 3. The positive expression of Nestin, NSE and GFAP in the bFGF group, the Liuwei Dihuang pill group and the bFGF + Liuwei Dihuang pill group were higher than that of the bFGF group and the Liuwei Dihuang pill group. (P0.0 5) Conclusion:1. The bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be gradually purified by the whole bone marrow adherent separation method, and the cell activity is high and the biological character is stable. 2. Liuwei Dihuang Wan can induce the directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells, and the combination of Liuwei Dihuang Wan and basic fibroblast growth factor can be obtained.
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2504164