【摘要】：目的:(1)在明確人轉(zhuǎn)化生長因子β(hTGF-β)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向骨組織細(xì)胞分化作用的基礎(chǔ)上,基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)BMSCs的hTGF-β1基因修飾;(2)研究hTGF-β1聯(lián)合hBMP-2協(xié)同誘導(dǎo)BMSCs成骨作用的影響,闡明其成為理想骨組織工程種子細(xì)胞價值。 方法:1.利用基因同源重組原理,通過AdMax腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建hTGF-β1重組腺病毒,以及對照組病毒pAdMax-EGFP-3FLAG. 2.目的基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立:(1)采用差速貼壁傳代篩選法和流式細(xì)胞鑒定相結(jié)合,分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;(2)通過腺病毒載體介導(dǎo)hTGF-β1基因轉(zhuǎn)染BMSCs,分別通過熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況,確定最佳感染復(fù)數(shù);(3)RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后BMSCs中hTGF-β1的表達(dá)情況;ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的表達(dá)。 3.雙基因修飾的BMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性分析:將外源基因修飾的BMSCs分為5組:A.正常MSCs組;B.空病毒修飾組;C.hBMP-2修飾組;D.hTGF-β1修飾組;E.hTGF-β1+ hBMP-2修飾組。 (1)采用MTT法測定各組細(xì)胞增殖能力; (2)酶促反應(yīng)檢測細(xì)胞堿性磷酸酶活性。 結(jié)果:(1)成功將hTGF-β1基因?qū)氡磉_(dá)載體pAV-MCMV-EGFP-3FLAG中,構(gòu)建了重組腺病毒Ad-hTGF-β1,DNA測序證明,所克隆目的基因序列與Genebank收錄一致。 (2)通過結(jié)合貼壁培養(yǎng)法和流式細(xì)胞鑒定高效、快速的分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并通過GFP熒光表達(dá)提示目的基因存在于所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中;RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有大量目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄;ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿中有目的蛋白的表達(dá)。 (3)不同基因修飾后的MSCs增殖能力均得到不同程度的增強(qiáng),其中hTGF-β1和hBMP-2共同修飾對促進(jìn)MSCs的增殖能力最明顯;ELISA檢測顯示雙轉(zhuǎn)組中MSCs的ALP活性明顯高于各單轉(zhuǎn)組。 結(jié)論:(1)利用新的AdMax腺病毒載體轉(zhuǎn)染方法可使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高效穩(wěn)定地表達(dá)hTGF-β1及hBMP-2基因; (2)利用兩種基因間的協(xié)同作用,聯(lián)合應(yīng)用hTGF-β1和hBMP-2可明顯促進(jìn)組織工程骨種子細(xì)胞的成骨化,效果優(yōu)于單用一種生長因子。
[Abstract]:Aim: (1) based on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) induced by human transforming growth factor 尾 (hTGF- 尾) into bone tissue cells, the hTGF- 尾 1 gene modification of BMSCs was realized based on transgenic technology. (2) to study the effect of hTGF- 尾 1 combined with hBMP-2 on BMSCs osteogenesis, and to elucidate its value as an ideal seed cell of bone tissue engineering. Method: 1. Based on the principle of gene homologous recombination, hTGF- 尾 1 recombinant adenoviruses and control virus pAdMax-EGFP-3FLAG. were constructed by AdMax adenoviral system. two銆，

本文編號：2503968