【摘要】：B淋巴細(xì)胞活化因子(B cell activating factor belonged to TNF family, BAFF)，又稱B淋巴細(xì)胞刺激因子，不僅能夠調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞功能，還能通過表達(dá)在活化T淋巴細(xì)胞上的跨膜激活劑及鈣調(diào)親環(huán)素配體相互作用分子(transmembraneactivator or calcium-modulating cyclophylin ligand-interactor, TACI)和BAFF受體(BAFF receptor, BAFFR)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，BAFF及其同系物增殖誘導(dǎo)配體(A proliferation-inducing ligand, APRIL)水平的異常與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)等自身免疫病的發(fā)病密切相關(guān)。重組人TACI-Ig融合蛋白（recombination humanTACI-Ig, rhTACI-Ig）包括TACI的胞外段和人免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)G1的Fc段，可以作為一種誘騙受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合BAFF和APRIL。本研究在用BAFF或抗CD3單抗體外活化C57BL/6小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的基礎(chǔ)上，觀察rhTACI-Ig對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的影響及分子機(jī)制；同時(shí)利用血藍(lán)蛋白（keyhole limpethaemocyanin, KLH）建立C57BL/6小鼠抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)模型，進(jìn)一步探討rhTACI-Ig的作用機(jī)制，為篩選治療以T淋巴細(xì)胞功能異常為主的自身免疫病藥物和尋找新的藥物作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 目的：觀察rhTACI-Ig體外對(duì)BAFF、抗CD3抗體或血藍(lán)蛋白作用的T淋巴細(xì)胞增殖、活化和分化功能的影響，并探討rhTACI-Ig作用的分子機(jī)制。 方法：采用BAFF (0.1μg/ml)或抗CD3抗體(10μg/ml)分別刺激脾臟T淋巴細(xì)胞，同時(shí)給予rhTACI-Ig (0.01,0.1,1,10,100μg/ml)、陽性對(duì)照藥rhTNFR:Fc (10μg/ml)或陰性對(duì)照藥IgG-Fc (10μg/ml)。3H-TdR參入法觀察各給藥組對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、干擾素-γ（interferon-gamma, IFN-γ）、轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor-β,TGF-β）水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞各亞群比率的變化情況；Western-blot法檢測(cè)BAFF介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路各相關(guān)蛋白表達(dá)情況。采用血藍(lán)蛋白免疫小鼠，取脾臟組織切片做病理分析，ELISA法檢測(cè)小鼠血清中KLH-IgM、KLH-IgG、BAFF、APRIL抗體水平及IL-2/IL-4比率；同時(shí)分離正常組和模型組小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞，體外分別用BAFF刺激，并給予rhTACI-Ig(0.01,0.1,1,10,100μg/ml)，3H-TdR參入法觀察各給藥組對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響，ELISA法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IFN-γ、TGF-β水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞各亞群百分率的變化情況。 結(jié)果: 1. RhTACI-Ig體外對(duì)BAFF或抗CD3抗體誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞功能的影響 1.1RhTACI-Ig體外對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響B(tài)AFF和抗CD3抗體體外均能刺激T淋巴細(xì)胞增殖，rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)體外可明顯抑制BAFF刺激的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng); rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)和rhTNFR:Fc (10μg/ml)可明顯抑制抗CD3抗體刺激的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。 1.2RhTACI-Ig體外對(duì)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平的影響 BAFF刺激可以使胸腺淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-4、IFN-γ和TGF-β水平明顯升高，rhTACI-Ig (10,100μg/ml)可以明顯降低IL-2水平；rhTACI-Ig (1,10,100μg/ml)可以明顯降低IL-4和TGF-β水平；rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)可以明顯降低IFN-γ水平；抗CD3抗體可使T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-4、IFN-γ和TGF-β水平明顯升高，rhTACI-Ig (1,10,100μg/ml)可不同程度降低上述細(xì)胞因子水平。RhTNFR:Fc可以明顯降低BAFF刺激的IL-4和IFN-γ水平，降低抗CD3抗體刺激的IL-2、IL-4水平。 1.3RhTACI-Ig體外對(duì)T淋巴細(xì)胞存活情況及其表面CD25和CD69分子動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的影響 BAFF刺激后CD69和CD25分子表達(dá)水平隨時(shí)間不斷增長，到72h為最高點(diǎn)，RhTACI-Ig體外能抑制CD25和CD69表達(dá)水平的升高；BAFF刺激能延長T淋巴細(xì)胞存活時(shí)間，rhTACI-Ig能抑制T淋巴細(xì)胞存活情況。 1.4RhTACI-Ig體外對(duì)T淋巴細(xì)胞各亞群比率的影響 BAFF體外刺激T淋巴細(xì)胞，可使活化Th細(xì)胞(CD4+/CD25+)和表達(dá)活化誘導(dǎo)分子Th細(xì)胞(CD4+/CD69+)比率顯著升高，未致敏Th細(xì)胞(CD4+CD62L+)比率顯著降低，對(duì)表達(dá)CD40L的Th細(xì)胞(CD4+/CD154+)比率沒有影響，rhTACI-Ig(0.1,1,10,100μg/ml)可明顯降低活化Th細(xì)胞和表達(dá)活化誘導(dǎo)分子Th細(xì)胞比率，rhTACI-Ig（10,100μg/ml）可明顯提高未致敏Th細(xì)胞的比率；抗CD3抗體體外刺激T淋巴細(xì)胞，可使表達(dá)活化誘導(dǎo)分子Th細(xì)胞和表達(dá)CD40L的Th細(xì)胞比率顯著升高，活化Th細(xì)胞和未致敏Th細(xì)胞比率顯著降低；rhTACI-Ig (10,100μg/ml)可顯著抑制表達(dá)活化誘導(dǎo)分子Th細(xì)胞比率，rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)可不同程度抑制表達(dá)CD40L的Th細(xì)胞比率，rhTACI-Ig (100μg/ml)可升高活化Th細(xì)胞比率，rhTACI-Ig(10μg/ml)可顯著提高未致敏Th細(xì)胞比率。 1.5RhTACI-Ig體外對(duì)BAFF介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路各分子表達(dá)的影響 BAFF能降低T淋巴細(xì)胞TACI受體表達(dá)，升高BAFFR受體表達(dá)，使IKKα和NF-κB p50表達(dá)水平升高，IκBα表達(dá)降低，但對(duì)IKKγ表達(dá)沒有明顯影響；rhTACI-Ig(1,10μg/ml),(0.1,1,10μg/ml)和(0.1,1,10μg/ml)能分別降低BAFF刺激的BAFFR、IKKα和NF-κB p50表達(dá)水平，rhTACI-Ig (10μg/ml)和(1,10μg/ml)能分別升高BAFF刺激的TACI和IκBα表達(dá)水平。 2. RhTACI-Ig體外對(duì)血藍(lán)蛋白免疫C57BL/6小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的作用 2.1KLH免疫小鼠血清中KLH-IgM、KLH-IgG、BAFF、APRIL、IL-2、IL-4水平及脾臟病理改變 KLH免疫小鼠脾臟動(dòng)脈周圍淋巴鞘細(xì)胞密度增高，淋巴濾泡異常增生，邊緣區(qū)細(xì)胞密度增大，紅髓充血評(píng)分以及生發(fā)中心數(shù)量增多；KLH免疫小鼠血清中KLH-IgM、KLH-IgG抗體水平均明顯升高， BAFF、APRIL水平升高，IL-2水平降低，IL-4水平顯著升高，導(dǎo)致IL-2/IL-4比率降低。 2.2RhTACI-Ig體外對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖情況的影響 血藍(lán)蛋白免疫小鼠T淋巴細(xì)胞增殖功能亢進(jìn)，BAFF能進(jìn)一步刺激T淋巴細(xì)胞增殖，rhTACI-Ig (1,10,100μg/ml)給藥組可以不同程度抑制T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。 2.3RhTACI-Ig體外對(duì)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中各細(xì)胞因子水平的影響 KLH免疫小鼠T淋巴細(xì)胞分泌IL-4和IL-5增多，IL-2分泌減少，IFN-γ分泌略有下降；BAFF刺激能進(jìn)一步增加IL-4、IL-5水平，提高IL-2水平和IFN-γ水平并遠(yuǎn)超正常值。RhTACI-Ig (100μg/ml)給藥組可顯著降低IL-4和IL-5水平，rhTACI-Ig (10,100μg/ml)給藥組可不同程度降低BAFF刺激的IL-2和IFN-γ的分泌水平。 2.4RhTACI-Ig體外對(duì)T淋巴細(xì)胞各亞群比率的影響 KLH模型組小鼠CD3+CD4+T、 CD3+CD69+、CD4+CD154+T淋巴細(xì)胞比率顯著升高，BAFF體外刺激能使其進(jìn)一步升高，rhTACI-Ig(1,10,100μg/ml)可以明顯抑制BAFF刺激的CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比率，rhTACI-Ig (10,100μg/ml)可以不同程度抑制BAFF刺激的CD3+CD69+和CD3+CD154+T淋巴細(xì)胞比率；KLH模型組小鼠CD4+CD62L+T淋巴細(xì)胞比率顯著降低，BAFF刺激能使其進(jìn)一步降低，rhTACI-Ig (0.1,1,10,100μg/ml)給藥組可以不同程度提高BAFF刺激的CD3+CD62L+T淋巴細(xì)胞比率。 結(jié)論： 1. RhTACI-Ig體外能抑制BAFF或抗CD3抗體刺激的T淋巴細(xì)胞增殖，降低升高的細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ、TGF-β)水平，調(diào)節(jié)各T淋巴細(xì)胞亞群比率，并能通過調(diào)節(jié)BAFFR和TACI受體的表達(dá)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路，達(dá)到治療效果。 2.血藍(lán)蛋白免疫小鼠血清中BAFF、APRIL、KLH-IgM、KLH-IgG抗體水平以及IL-4水平均增高，IL-2水平降低；脾臟動(dòng)脈周圍淋巴鞘細(xì)胞密度增高，淋巴濾泡異常增生，，邊緣區(qū)細(xì)胞密度增大，紅髓充血評(píng)分以及生發(fā)中心數(shù)量增多。RhTACI-Ig體外能抑制BAFF刺激的KLH模型小鼠T淋巴細(xì)胞增殖情況，調(diào)節(jié)各細(xì)胞因子水平和T淋巴細(xì)胞亞群比率，其抑制作用可能是通過中和內(nèi)源性和外源性BAFF和APRIL而發(fā)揮的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2495102