【摘要】：【研究目的】 疼痛是人體各部分受到損傷性刺激引起的不愉快的感覺，它提供軀體受到威脅的警報信號，是生命不可缺少的一種特殊保護功能。但另一方面，嚴重的慢性疼痛困擾著數(shù)以百萬計的人們，是臨床的一大難題。因而了解疼痛產(chǎn)生的機制，尋找解除疼痛的方法，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。臨床觀察早就注意到疼痛有明顯的性別差異，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：①腸易激綜合征（Irritable Bowel Syndrome， IBS）、間質(zhì)性膀胱炎（Interstitial Cystitis，IC）、顳下頜關(guān)節(jié)炎等病癥多見于女性；②這些病癥與月經(jīng)和性激素周期相關(guān)[1]。這些證據(jù)表明雌激素可能參與痛覺的調(diào)節(jié)。 ATP不僅是一種供能物質(zhì)，而且還通過與特異的受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用。這種特異性ATP受體即為“嘌呤受體”，按激動劑的選擇性分為P1和P2兩大類。P2受體被分為P2X和P2Y兩大類，目前已有7種P2X受體蛋白序列被克隆出來(P2X1-P2X7)。而目前研究的較多的是P2X3受體，它一般在胞漿表達，在胞膜發(fā)揮作用，選擇性地表達于初級傳入感覺神經(jīng)元如背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)上，且以中、小型神經(jīng)節(jié)細胞為主。P2X3受體可由脊神經(jīng)節(jié)胞體合成后轉(zhuǎn)運到中樞端與外周端，其中樞端軸突末梢投射入脊髓背角的Ⅱ?qū)由畈�，外周端分布至皮膚、舌體和內(nèi)臟等器官[2]。運用P2X3受體選擇性拮抗劑A-317491、反義寡核苷酸、RNA干擾和基因敲除技術(shù)后，痛覺敏感性顯著降低，進一步表明ATP和P2X3受體參與并調(diào)制多種疼痛信號的傳遞[3]。 在體內(nèi)，雌激素與其特異性受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)作用。經(jīng)典的雌激素受體（ER）是核受體超家族成員之一，分為α和β兩種亞型，他們廣泛分布于各種組織，介導(dǎo)雌激素的多種效應(yīng)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ERs也有廣泛分布。神經(jīng)解剖學(xué)研究顯示，ERα和ERβ廣泛分布于痛覺傳遞和調(diào)制通路中，如背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角(主要分布在板層Ⅱ，在板層I、III、V和X也有一定程度的分布)、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、臂旁核、脊核、下丘腦、大腦邊緣系統(tǒng)和幾個皮質(zhì)區(qū)等區(qū)域[4]。由于ERα、β是核受體，雌激素必須穿過細胞膜進入細胞才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，所以，作用比較慢。然而，近些年研究發(fā)現(xiàn)，雌激素還有快速作用（幾分鐘內(nèi)），這表明雌激素可以與細胞膜上某種蛋白結(jié)合，進而發(fā)揮作用，后來人們發(fā)現(xiàn)，細胞膜上存在一種雌激素受體GPR30[5]。也有人發(fā)現(xiàn)，，雌激素核受體也可以轉(zhuǎn)移到膜上參與完成這種快速作用[6]。 因而在本課題中，我們運用動物行為學(xué)、全細胞膜片鉗等方法，從整體、細胞水平研究雌激素對P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的快速調(diào)節(jié)作用。重點探討急性炎癥條件下雌激素對初級感覺傳入神經(jīng)元（DRG）上P2X3受體的功能影響，對于闡明疼痛的性別相關(guān)性，以及將來研制新一代的鎮(zhèn)痛劑，具有重要的意義。 【研究方法】 電生理學(xué)實驗： 急性分離培養(yǎng)小鼠或大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元，通過全細胞膜片鉗方法記錄P2X3受體介導(dǎo)的瞬時型ATP電流，并給與一定濃度的雌二醇（E2）或相應(yīng)雌激素受體的激動劑，并且給予相關(guān)細胞信號通路酶的抑制劑，觀察α,β-me-ATP介導(dǎo)的電流的變化。 行為學(xué)實驗： 1、雌二醇（E2）對外周痛覺的抑制作用 （1）E2對外周機械痛閾的影響 16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為saline和E2兩組，分別在左腳足底皮下注射saline和E2后，以機械刺激（Von Frey filaments）為研究方法，分別于注射后0、10、30、50、70、90min觀察兩組的縮腿閾值（PWT）的差異。 （2）E2對α,β-me-ATP誘導(dǎo)的外周自發(fā)痛的影響 16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為saline和E2兩組，分別在左腳足底皮下注射saline+α,β-me-ATP和E2+α,β-me-ATP，觀察注射后縮腿時間（PWD）的差異。 2、ERα及GPR30激活對P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺的抑制作用 （1）ERα激活抑制了P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺 24只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為Ethanol、PPT、DPN三組，分別在左腳足底皮下注射Ethanol+α,β-me-ATP、PPT+α,β-me-ATP和DPN+α,β-me-ATP，觀察注射后縮腿時間（PWD）的差異。 （2）GPR30激活抑制了P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺 16只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為DMSO、G-1兩組，分別在左腳足底皮下注射DMSO+α,β-me-ATP、G-1+α,β-me-ATP、觀察注射后縮腿時間（PWD）的差異。 3、ERK1/2途徑參與了雌二醇（E2）對P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的快速抑制作用 32只雌性Sprague-Dawley大鼠，分為saline、E2、U0126和E2+U0126四組，分別在左腳足底皮下注射saline+α,β-me-ATP、E2+α,β-me-ATP、U0126+α,β-me-ATP和E2+α,β-me-ATP+U0126，觀察注射后縮腿時間（PWD）的差異。 【結(jié)果】電生理學(xué)實驗： 1、在ERα、ERβ受體野生型和基因敲除型鼠分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元細胞上，野生型鼠中，雌二醇（E2）可以快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的電流；而在ERα受體敲除鼠中，雌二醇（E2）對P2X3受體介導(dǎo)的電流沒有明顯影響；在ERβ受體敲除鼠中，雌二醇（E2）可以部分抑制P2X3受體介導(dǎo)的電流。 2、ERα特異性激動劑PPT、GPR30特異性激動劑G-1均能抑制P2X3受體介導(dǎo)的電流,ERβ特異性激動劑DPN對P2X3受體介導(dǎo)的電流沒有明顯的影響。GPR30拮抗劑G-15能逆轉(zhuǎn)E2對P2X3受體介導(dǎo)的電流的抑制作用。 3、ERK1/2拮抗劑U0126能逆轉(zhuǎn)ERα特異性激動劑PPT、GPR30特異性激動劑G-1對P2X3受體介導(dǎo)的電流的抑制作用。 4、另一個ERK1/2拮抗劑PD98059能逆轉(zhuǎn)E2對P2X3受體介導(dǎo)的電流的抑制作用行為學(xué)實驗： 1、弗萊毛（Von Frey filaments）測試顯示，在正常雌性大鼠中，saline組和E2組PWT有顯著差異，50min后，E2組顯著高于saline組，且E2組PWT隨時間逐漸降低。 2、在α,β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，saline組和E2組間PWD有顯著性差異，E2組低于saline組。 3、在α,β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，Ethanol組、PPT組和DPN組間PWD有顯著差異，PPT組低于Ethanol組，但DPN組與Ethanol組沒有明顯差異，表明了ERα受體激活對P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺的抑制作用。 4、在α,β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，DMSO組和G-1組間PWD有差異顯著，G-1組的PWD低于DMSO組，表明了GPR30激活對P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺的抑制作用。 5、在α,β-me-ATP誘導(dǎo)的急性炎性痛模型的雌性大鼠中，saline組、E2組、U0126組和E2+U0126組間PWD有顯著差異，U0126組與saline組間無顯著差異。E2組顯著低于saline組，E2+U0126組顯著高于E2組，但E2+U0126組與saline組沒有明顯差異，提示了U0126能逆轉(zhuǎn)E2對P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺的抑制作用，即ERK1/2途徑參與了這種作用。 【結(jié)論】 1、ERα受體敲除后，雌二醇（E2）對P2X3受體介導(dǎo)的電流抑制作用消失；ERβ受體敲除后，雌二醇（E2）對P2X3受體介導(dǎo)的電流仍存在部分抑制作用。 2、ERα特異性激動劑PPT快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的瞬時電流；ERβ特異性激動劑DPN對P2X3受體介導(dǎo)的瞬時電流沒有明顯影響。 3、GPR30特異性激動劑G-1快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的瞬時電流；雌二醇（E2）對P2X3受體介導(dǎo)的瞬時電流的抑制作用可以被GPR30特異拮抗劑G-15阻斷。 4、ERK1/2抑制劑U0126能阻斷PPT、G-1對于P2X3受體介導(dǎo)的電流抑制作用，另一個ERK1/2抑制劑PD98059能阻斷雌二醇（E2）對于P2X3受體介導(dǎo)的電流抑制作用。 5、雌二醇（E2）、PPT、G-1快速抑制P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺，DPN無明顯作用。 6、ERK1/2的抑制劑U0126能逆轉(zhuǎn)雌二醇（E2）對P2X3受體介導(dǎo)的外周痛覺的抑制作用。 綜上所述，雌激素對外周痛覺的調(diào)節(jié)可能通過作用于初級感覺傳入神經(jīng)元上ERα、GPR30等受體，并影響P2X3受體的功能來實現(xiàn)，且這一調(diào)節(jié)作用可能包括胞內(nèi)ERK1/2途徑的參與。這些結(jié)果不僅進一步證實了雌激素對于外周痛覺的形成具有抑制性調(diào)節(jié)作用，而且首次發(fā)現(xiàn)這種調(diào)節(jié)作用主要通過ERα和GPR30等受體來介導(dǎo)，這一調(diào)節(jié)作用在外周痛覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的水平就已經(jīng)存在。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2491091