【摘要】：microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約為23個核苷酸的單鏈非編碼RNA,主要由RNA多聚酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄,經(jīng)核糖核酸酶Ⅲ (Drosha及Dicer)剪切形成。成熟microRNA通過堿基配對與靶基因mRNA的3'-UTR相結(jié)合,造成靶基因mRNA的降解或蛋白翻譯水平上受抑制,從而對靶基因的表達進行負向調(diào)控。microRNA參與多種生物學(xué)過程,對器官形成及組織分化均有重要作用。據(jù)目前文獻報道,至少有30余組microRNA在成人血細胞中有獨特的表達,其中多組microRNA與造血干細胞的分化有關(guān),并且與胚胎造血中的關(guān)鍵因子相互作用,但它們在胚胎造血中的功能仍有待于進一步的探討。 為了揭示microRNA在哺乳動物胚胎造血中的作用,本文以小鼠胚胎干細胞誘導(dǎo)分化形成的擬胚體作為胚胎發(fā)育的模型。第一步,在先前實驗積累數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,初步確定了在胚胎血發(fā)生中有特異性表達的候選microRNA。其次,為了驗證這些候選microRNA是否能夠調(diào)控胚胎血發(fā)生,我們首先構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,通過反轉(zhuǎn)錄病毒在小鼠胚胎干細胞中過表達候選microRNA。再次,我們構(gòu)建了能在條件誘導(dǎo)過表達候選microRNA的小鼠胚胎干細胞系,可在擬胚體發(fā)育的特定時間段利用四環(huán)素誘導(dǎo)高表達候選microRNA,再利用實時熒光定量和流式細胞分析等方式檢測血發(fā)生及胚胎發(fā)育的變化情況,并對數(shù)據(jù)進行分析后得到了候選microRNA的可能調(diào)節(jié)因子及下游靶基因。這部分工作為下一步研究這些候選microRNA的作用途徑并找出它們的直接作用位點奠定了基礎(chǔ)。 另外,為了方便研究microRNA及其他外源性基因在人類胚胎干細胞中的作用,本文嘗試構(gòu)建了條件誘導(dǎo)基因表達人類胚胎干細胞系。通過在Actb基因的3’UTR區(qū)域發(fā)生同源重組,導(dǎo)入了四環(huán)素調(diào)控啟動子,潮霉素(Hygromycine)抗性基因,定點重組酶系統(tǒng)元件(LoxP, Frt)等序列。在成功整合之后,就能夠更進一步地定點重組入外源基因并可在四環(huán)素衍生物強力霉素誘導(dǎo)下表達轉(zhuǎn)入的外源基因或microRNA。這個細胞系為我們研究在人類胚胎干細胞中研究基因或microRNA的功能提供了一個相當(dāng)有用的工具。
[Abstract]:MicroRNA is a class of single strand non-coding RNA, with a length of about 23 nucleotides found in recent years, which is mainly transcribed by RNA polymerase II and cut by ribonuclease III (Drosha and Dicer). Mature microRNA binds to the 3'-UTR of target gene mRNA through base pairing, resulting in the degradation of target gene mRNA or the inhibition of protein translation level, thus negatively regulating the expression of target gene. MicroRNA is involved in a variety of biological processes. It plays an important role in organ formation and tissue differentiation. According to the current literature, at least 30 groups of microRNA have unique expression in adult blood cells, among which many groups of microRNA are related to the differentiation of hematopoietic stem cells and interact with key factors in embryonic hematopoiesis. However, their function in embryonic hematopoiesis still needs to be further discussed. In order to reveal the role of microRNA in embryonic hematopoiesis in mammals, the embryoid induced by mouse embryonic stem cells was used as a model of embryonic development. In the first step, on the basis of the accumulation of data in previous experiments, the candidate microRNA. with specific expression in embryonic hematogenesis was preliminarily determined. Secondly, in order to verify whether these candidate microRNA can regulate embryonic hematogenesis, we first constructed retrovirus vector and overexpressed candidate microRNA. in mouse embryonic stem cells by retrovirus. Thirdly, we constructed a mouse embryonic stem cell line which can overexpress candidate microRNA in conditional induction, which can induce high expression candidate microRNA, by tetracycline at a specific time of embryoid development. The changes of hematogenesis and embryonic development were detected by real-time fluorescence quantitative analysis and flow cytometry, and the possible regulatory factors and downstream target genes of candidate microRNA were obtained after the data were analyzed. This part of the work lays a foundation for the next step to study the pathway of action of these candidate microRNA and find out their direct sites of action. In addition, in order to facilitate the study of the role of microRNA and other exogenous genes in human embryonic stem cells, a conditional induced gene expression human embryonic stem cell line was constructed. By homologous recombination in the 3'UTR region of Actb gene, tetracycline regulated promoter, hygromycin (Hygromycine) resistance gene and site-directed recombinant enzyme system element (LoxP, Frt) were introduced. After successful integration, the foreign gene can be further recombined into the foreign gene and the transferred foreign gene or microRNA. can be expressed under the induction of doxycycline derivative doxycycline. This cell line provides a useful tool for us to study the function of genes or microRNA in human embryonic stem cells.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R3411

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 桂樂;吳翔;郭新;秦小同;魏美芳;景宏美;;前體脂肪細胞分化相關(guān)的miRNA表達變化[J];中國老年學(xué)雜志;2008年21期

2 劉俊;黃陳;江_";鐘福全;;microRNA在胰腺癌中的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2009年23期

3 王雪;王紅靜;;微小RNA與卵巢癌的研究進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2010年08期

4 劉東;陳云昭;李鋒;;microRNA與食管癌關(guān)系的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2010年05期

5 黃文濤;郭向前;戴甲培;陳潤生;;MicroRNA,lncRNA與神經(jīng)退行性疾病[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2010年08期

6 高玉;吳晉暉;柳林;;哺乳動物視網(wǎng)膜microRNA的表達及功能[J];眼科新進展;2010年08期

7 吳微;楊歡;;MicroRNA與自身免疫性疾病[J];免疫學(xué)雜志;2010年12期

8 涂軼;梅金紅;;乳腺癌相關(guān)microRNA研究進展[J];實用臨床醫(yī)學(xué);2010年11期

9 胡慶偉;杜英;梅麗娜;邢建民;鄧再興;;微小RNA-200家族在子宮內(nèi)膜癌中的表達及意義[J];中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2011年03期

10 蔣海鋒;薄雋杰;;MicroRNA與膀胱癌的研究進展[J];中國癌癥雜志;2011年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李炯;段德民;鄭克孝;;新型非標(biāo)記高通量microRNA芯片技術(shù)[A];第一屆全國生物物理化學(xué)會議暨生物物理化學(xué)發(fā)展戰(zhàn)略研討會論文摘要集[C];2010年

2 王俊峰;李巍;吳小江;阮康成;;大鼠附睪microRNA表達譜的研究[A];第十一次中國生物物理學(xué)術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

3 蔣義國;劉斌斌;;毒理學(xué)中的microRNA研究[A];廣東省環(huán)境誘變劑學(xué)會、廣東省預(yù)防醫(yī)學(xué)會衛(wèi)生毒理專業(yè)委員會2010年學(xué)術(shù)會議資料匯編[C];2010年

4 鞏麗穎;孫開來;;兩種microRNA在先心病心肌組織中的表達[A];中國的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學(xué)會大會論文摘要匯編[C];2011年

5 李夢龍;;Systematically analyze and select key features to microRNA precursors identification based on random forests[A];第十一屆全國計算（機）化學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2011年

6 徐晨;鮑堅強;李定;郭強蘇;;microRNA-449在小鼠精子發(fā)生過程中的作用研究[A];中國解剖學(xué)會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

7 江建霞;蔣晶晶;曹家樹;;白菜花粉發(fā)育及授粉受精過程相關(guān)microRNA篩選及驗證[A];中國園藝學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

8 劉娜;楊景華;張明方;;嫁接西瓜microRNA的鑒定以及表達差異研究[A];中國園藝學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

9 李鴻;屈晶晶;王睿;盛春君;程曉蕓;王吉影;蘇斌;柴尚玉;曲伸;;體外培養(yǎng)胰島的microRNA表達譜及功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

10 王國坤;朱嘉琦;荊清;秦永文;;缺氧刺激影響心肌細胞釋放microRNA[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 陳英云 喬蕤琳;哈醫(yī)大成功研發(fā)國內(nèi)首例microRNA轉(zhuǎn)基因及敲減小鼠模型[N];黑龍江經(jīng)濟報;2010年

2 記者 朱敏麗;醫(yī)藥城創(chuàng)新牛奶檢測技術(shù)[N];泰州日報;2010年

3 記者 許曉惠;乳品中微小核糖核酸科研成果公布[N];中國食品質(zhì)量報;2010年

4 衣曉峰;哈醫(yī)大發(fā)現(xiàn)心肌肥厚發(fā)生發(fā)展新機制[N];中國醫(yī)藥報;2010年

5 記者 鄭曉春;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞分化機制[N];科技日報;2008年

6 張樹庸　趙貴英;干細胞研究的突破[N];人民日報;2009年

7 孫國根;復(fù)旦大學(xué)成功提取首個大鼠胚胎干細胞[N];中國醫(yī)藥報;2009年

8 本報首席記者 任荃;第二顆“全能種子”會不會搶先“發(fā)芽”[N];文匯報;2009年

9 記者 李大慶;“小小”入選《時代周刊》2009年十大醫(yī)學(xué)突破[N];科技日報;2009年

10 曹淑芬;用胚胎干細胞生成骨骼[N];中國中醫(yī)藥報;2001年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王雷;胰管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤：臨床特征與microRNA的差異表達[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 崔熠;microRNA在砷致胚胎發(fā)育毒性中的作用機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

3 王鎮(zhèn);食管黏膜鱗狀上皮癌變相關(guān)microRNA的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

4 侯晉;microRNA在病毒感染和肝細胞癌中的作用及相關(guān)機制研究[D];清華大學(xué);2010年

5 駱黎靜;人卵巢癌干細胞的分離、鑒定及其特異性microRNA的篩選[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

6 于曼麗;Let-7d對血管平滑肌細胞增殖調(diào)控的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

7 陳勇;microRNA-200c在胃癌SGC7901/CDDP細胞中的作用及其機制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

8 于琦;雄激素受體在乳腺癌中表達意義和相關(guān)microRNA篩選的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

9 翁春華;血管生成素特異microRNAs的鑒定與功能分析[D];浙江大學(xué);2010年

10 袁圓;全腦缺血再灌注后大鼠海馬microRNA的變化及Let-7e調(diào)控Caspase-3表達和機制研究[D];浙江大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 宋永站;microRNA-200c對ZEB1表達影響及對腫瘤細胞侵襲遷移作用[D];江蘇大學(xué);2010年

2 胡德亮;microRNA-19b在P19細胞向心肌細胞分化中的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

3 曲婷;基于生物信息學(xué)方法的H1N1流感病毒致病及傳播特性研究[D];吉林大學(xué);2010年

4 呂賽群;基于microRNA調(diào)控靶向腫瘤細胞的溶瘤腺病毒的研究[D];浙江理工大學(xué);2010年

5 張秀梅;韌帶成纖維細胞成骨分化過程microRNA、mRNA和蛋白表達譜分析[D];濟南大學(xué);2011年

6 孫佃臣;低磷脅迫響應(yīng)microRNA及靶基因的克隆和大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

7 吉娜;自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌和纖維化腎臟組織中microRNA-21的表達[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

8 陳娟;靶向Livin的microRNA干擾對人卵巢癌細胞SKOV3體外作用的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

9 梅林;卡氏肺孢子菌MSG-UCS基因microRNA表達載體的構(gòu)建和鑒定[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

10 孔飛飛;靶向YB-1基因的MicroRNA對乳腺癌MDA-MB-231細胞惡性生物學(xué)行為的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號：2487789