【摘要】：【研究背景】肌源性干細胞（muscle-derived stem cells, MDSCs）是一類新近發(fā)現(xiàn)的成體干細胞，可以從動物的骨骼肌中分離獲得，具有干細胞的自我更新和多向分化的潛能。MDSCs在體內(nèi)/外分化成肌肉細胞時不需要特定的刺激，但讓MDSCs分化成骨骼肌細胞以外的其它譜系細胞時，可能需要特殊的生長因子刺激或?qū)⑵渲糜谶m宜的環(huán)境中。越來越多的研究表明，MDSCs在特定組織的發(fā)育、組織再生及修復和基因治療方面的巨大潛能。有證據(jù)顯示，MDSCs能夠促進肌纖維的再生，增強再生肌組織的功能，并具有分化為神經(jīng)外膜組織細胞和具有雪旺細胞（Schwann cells,SCs）表型細胞的潛能，為神經(jīng)組織工程研究中尋找雪旺細胞替代物帶來了希望。Neu基因調(diào)節(jié)素-1（neuregulin-1,NRG1）是一種由膜攜帶或分泌的多肽，屬于表皮生長因子（Epidermal Growth Factor,EGF）家族，主要是由神經(jīng)元產(chǎn)生，能與ErbB酪氨酸激酶受體相結(jié)合，引起廣泛的生物學效應。根據(jù)其N端結(jié)構(gòu)域的不同可將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種亞型。最近的研究表明軸突中NRG1Ⅲ型（sensory and motor neuron-derivedfactor,SMDF）的水平是髓鞘形成的一個關鍵指標。它不僅能促進雪旺細胞的增殖、分化，而且還調(diào)節(jié)軸突的髓鞘化及髓鞘的厚度。SMDF的分泌在胚胎期和新生期達到高峰，而成年后的表達明顯減少。在周圍神經(jīng)損傷后，，雪旺細胞及神經(jīng)支配的靶器官—肌組織中均可見其表達，然而其表達量不足以支持成年軸突完成再髓鞘化過程，僅能形成包繞軸突的薄髓鞘和變短的節(jié)間長度。也有研究顯示，雪旺細胞自身可以產(chǎn)生NRG1（Ⅲ型α2同源體），以自分泌或旁分泌的形式促進雪旺細胞增殖，并參與到清除病變軸突和髓鞘的過程中。周圍神經(jīng)損傷后，雪旺細胞分化和增殖是軸突再生的必備條件，而SMDF是髓鞘厚度的關鍵調(diào)節(jié)因子。因此，提高周圍神經(jīng)損傷處SMDF蛋白水平為雪旺細胞的髓鞘化過程提供了一個潛在的治療策略。 【研究目的】（1）采用新生小鼠坐骨神經(jīng)培養(yǎng)純化后的雪旺細胞條件培液，誘導小鼠MDSCs向雪旺細胞方向分化，為組織工程研究尋找新的雪旺細胞替代物；（2）克隆SMDF基因和構(gòu)建SMDF真核表達載體，為進一步的功能研究提供有力的工具；（3）鑒定轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-SMDF的MDSCs，研究SMDF基因在mRNA和蛋白水平的表達，進一步證實構(gòu)建的載體能有效的轉(zhuǎn)導目的基因；（4）證實SMDF基因可促進類雪旺細胞的增殖、分化的，進一步驗證SMDF蛋白的功能，為研究周圍神經(jīng)損傷后SCs髓鞘化過程及分子機制奠定了實驗基礎。 【研究方法】（1）應用改良的Preplate技術，從新生小鼠骨骼肌中分離MDSCs，利用抗體Desmin和Sca-1對分離得到的MDSCs進行免疫細胞化學鑒定；（2）從新生小鼠坐骨神經(jīng)分離純化雪旺細胞，利用抗體P75NTR、S-100β進行鑒定并收集雪旺細胞的條件培液用以誘導MDSCs分化為類雪旺細胞；（3）利用Western Blot對不同組織中SMDF蛋白的表達情況進行分析，利用免疫組織化學的方法鑒定SMDF在DRG中的表達；（4）針對小鼠SMDF基因mRNA全序列設計引物，Trizol法提取新生小鼠DRG總RNA，通過RT-PCR得到SMDF基因編碼區(qū)全序列，利用DNA重組技術將該基因片段重組到pEGFP-N2真核表達質(zhì)粒上，構(gòu)建重組真核表達載體pEGFP-N2-SMDF，并通過PCR、酶切及測序的方法進行鑒定；（5）應用脂質(zhì)體介導的方法將真核表達載體pEGFP-N2-SMDF和空質(zhì)粒pEGFP-N2轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MDSCs，通過PCR、Western-blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后SMDF基因和蛋白的表達情況。（6）采用雪旺細胞條件培液誘導轉(zhuǎn)染SMDF基因的MDSCs分化為類雪旺細胞，并采用免疫細胞化學的方法進行鑒定。 【結(jié)果】（1）應用改良的Preplate技術，從小鼠骨骼肌中分離得到MDSCs，能在體外穩(wěn)定增殖傳代，Desmin和Sca-1免疫細胞化學染色陽性；（2）從新生小鼠坐骨神經(jīng)中分離純化得到雪旺細胞，將收集的雪旺細胞條件培液加入MDSCs中，成功誘導出能表達雪旺細胞特異性標記物P75NTR、S-100β的細胞；（3）將小鼠DRG中的SMDF基因克隆至真核表達載體pEGFP-N2上，雙酶切、PCR和DNA測序鑒定結(jié)果表明，插入的序列與GenBank上小鼠SMDF基因CDS序列完全符合；（4）pEGFP-N2-SMDF真核表達載體轉(zhuǎn)染MDSCs后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達；PCR和Western-blot結(jié)果顯示，重組載體pEGFP-N2-SMDF轉(zhuǎn)染后的細胞中SMDF mRNA水平和蛋白水平的表達明顯高于空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組細胞，而后兩者間比較無統(tǒng)計學差異；轉(zhuǎn)染SMDF基因的MDSCs，經(jīng)雪旺條件培液誘導后可分化為類雪旺細胞，且S-100β的陽性率明顯高于直接誘導的類雪旺細胞。 【結(jié)論】（1）采用雪旺細胞條件培液，能夠?qū)⑿律∈蠊趋兰≈蟹蛛x得到的MDSCs誘導分化為類雪旺細胞，為組織工程神經(jīng)研究找到了新的種子細胞替代物；（2）成功將重組的真核表達載體pEGFP-N2-SMDF轉(zhuǎn)染至MDSCs中，轉(zhuǎn)染后的細胞中SMDF的mRNA水平和蛋白水平都顯著增高，同時證實SMDF基因可促進類雪旺細胞的增殖、分化，為進一步研究周圍神經(jīng)損傷后雪旺細胞髓鞘化過程及分子機制奠定了實驗基礎
[Abstract]:[Study Background] Muscle-derived stem cells (MDSCs) are a new type of adult stem cells, which can be isolated from the skeletal muscle of the animal and have the potential of self-renewal and multi-directional differentiation of the stem cells. The MDSCs do not need a specific stimulus when the MDSCs differentiate into muscle cells in vivo/ out, but may require special growth factors to stimulate or place them in a suitable environment. An increasing number of studies have shown that MDSCs can promote the regeneration of muscle fibers, enhance the function of the regenerated muscle tissue, and have the potential to differentiate into the outer membrane histiocytes and Schwann cells (SCs) phenotype cells. Increasing the level of the SMDF protein at peripheral nerve injury provides a potential therapeutic strategy for the treatment of Schwann cells. [Study objective] (1) The induced mouse MDSCs were induced to differentiate in the direction of Schwann cells, and the new Schwann cell replacement was found for tissue engineering. (2) The SMDF gene was cloned and the SMDF eukaryotic expression vector was constructed to provide a powerful tool for further functional research. (3) The MDSCs transfected with pEGFP-N2-SMDF were identified, the expression of the SMDF gene in the mRNA and protein level was studied, and the constructed vector was further proved to be effective for transduction of the target gene. (4) The SMDF gene was confirmed to promote the proliferation and differentiation of the Schwann cells and further verify the function of the SMDF protein. The invention discloses a method for preparing a recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-N2-SMDF by using an improved Preplate technique to separate MDSCs from the skeletal muscle of a newborn mouse, and carrying out immunocytochemical identification on the MDSCs obtained by the separation by using the antibody Desmin and the Sca-1; (2) separating and purifying the Schwann cells from the sciatic nerve of the newborn mouse, and identifying and collecting the conditions of the Schwann cells to induce the MDSCs to be differentiated into a class of Schwann cells by using the antibody P75NTR and the S-100 antigen; (3) analyzing the expression of the SMDF protein in different tissues by using the Western Blot; (3) using the Western Blot to analyze the expression of the SMDF protein in the different tissues; (4) extracting the whole sequence of the SMDF gene coding region by using the Western Blot; and (4) the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-N2-SMDF is constructed by using the DNA recombination technology to extract the whole sequence of the SMDF gene coding region by the RT-PCR, and the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-N2-SMDF is constructed by using the DNA recombination technology to obtain the whole sequence of the SMDF gene coding region. and (6) inducing MDSCs that transfect the SMDF gene into a class of Schwann cells by using a Schwann cell culture solution, and adopting a method of immunocytochemistry Line identification.[Results] (1) The modified Preplate technique was used to separate and purify the MDSCs from the skeletal muscle of the mouse, and the cells were chemically stained for Desmin and Sca-1. (2) The Schwann cells were isolated and purified from the sciatic nerve of the newborn mice, and the collected Schwann cell conditioned medium was added to the MDSCs to successfully induce the expression of the Schwann cell-specific marker P75NTR and S-100 antigen. (3) The SMDF gene in the DRG of the mouse was cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-N2, and the expression of the green fluorescent protein was observed under the fluorescence microscope after the expression of the pEGFP-N2-SMDF eukaryotic expression vector was transfected into the MDSCs. The results of the PCR and the Western-blot showed that the expression of the SMDF mRNA in the cells transfected with the recombinant vector pEGFP-N2-SMDF was confirmed by PCR and Western-blot. Schwann cells were found in Schwann cells.[Conclusion] (1) Schwann cells were used to induce MDSCs to differentiate into Schwann cells, and a new seed cell replacement was found for the study of tissue engineering. (2) The recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-N2-SMDF was successfully transfected into MDSCs, and the mRNA level and protein level of SMDF in the transfected cells increased significantly, and the SMDF gene was confirmed to promote the proliferation and differentiation of Schwann cells.
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2478392