【摘要】：肝臟是一個天然免疫耐受器官。很早就觀察到,肝臟移植后易誘導(dǎo)受體免疫耐受；一些嗜肝病原體如：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV).丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)和瘧疾易導(dǎo)致機體形成長期慢性感染,并誘導(dǎo)全身免疫耐受。如：與正常人相比,外周免疫乙肝疫苗后HBV攜帶者并不能產(chǎn)生保護性抗體。但是,目前我們對肝臟免疫耐受形成的機理,以及肝臟免疫耐受如何進一步誘導(dǎo)全身免疫耐受的細胞機制均知之甚少,探索其機制機理對慢性肝炎的臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。 本研究通過高壓注射HBV質(zhì)粒pAAV/HBV1.2,建立了HBV慢性感染成年小鼠模型。利用該模型深入探索了肝臟免疫耐受的形成以及如何誘導(dǎo)外周免疫耐受的機理。我們采用免疫放射法(IRMA)定量檢測小鼠血清中乙肝表面抗原、表面抗體,定量PCR檢測血清中HBV DNA拷貝數(shù)等指標(biāo)來評價小鼠是否處于慢性感染HBV狀態(tài)；采用賴氏法檢測血清轉(zhuǎn)氨酶ALT水平、H-E染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化來判斷肝細胞損傷程度：并利用上述指標(biāo)綜合評估小鼠慢性感染HBV模型是否成功,并將高壓注射HBV質(zhì)粒4周后血清中HBsAg較高的小鼠定義為HBV攜帶鼠(HBV carrier mice)(100ng/m);通過外周脾臟免疫HBsAg/CFA檢測血清中anti-HBs說明HBV鼠對HBsAg處于免疫耐受狀態(tài),進一步細胞轉(zhuǎn)輸來證明耐受具有可傳遞性。細胞清除實驗研究各細胞亞群在肝臟免疫耐受中的相互作用；采用ELISA和多細胞因子檢測的方法檢測體外細胞培養(yǎng)上清中IL-10、TGF-β、IFN-γ和IL-4等細胞因子的濃度；采用流式細胞術(shù)分析在HBV鼠中負調(diào)細胞抑制HBsAg外周免疫應(yīng)答的過程。通過上述一系列實驗方法取得的實驗結(jié)果如下： 1.成年小鼠HBV慢性感染模型的建立 有文獻報道通過尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒的方法能建立成年C57BL/6小鼠慢性感染HBV的模型。我們通過摸索不同劑量的注射質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)6gg質(zhì)粒能使小鼠血清中HBsAg持續(xù)保持較高濃度,5周后小鼠HBV陽性率100%,肝臟組織免疫組化的結(jié)果同樣證實5周后,HBV鼠肝臟中存在HBcAg陽性細胞；通過ALT檢測以及H-E染色發(fā)現(xiàn),HBV鼠肝臟組織并沒有淋巴細胞浸潤、肝臟損傷等出現(xiàn)；將血清中HBsAg含量與HBV DNA拷貝數(shù)進行比較,發(fā)現(xiàn)二者之間呈明顯的相關(guān)性。與6μg質(zhì)粒結(jié)果相反,小鼠高壓注射20μg pAAV/HBV1.2質(zhì)粒后,在4周左右,小鼠血清中HBsAg急劇下降,第5周時,HBsAg陽性率為0。因此,6μg pAAV/HBV1.2高壓注射可以獲得穩(wěn)定、可重復(fù)、標(biāo)準(zhǔn)的HBV慢性感染模型。 為了方便觀察高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒后,小鼠有哪些器官組織表達抗原。我們將GFP表達框插入pAAV/HBV1.2質(zhì)粒,使得質(zhì)粒進入細胞后能表達很強的GFP蛋白。通過免疫熒光以及免疫組化方法,我們發(fā)現(xiàn)只有肝臟組織在高壓注射后表達GFP蛋白,而心臟、肺臟和腎臟都不表達GFP蛋白,因此高壓注射質(zhì)粒后只能靶向進入肝臟,并啟動表達蛋白。 2.HBV攜帶鼠誘導(dǎo)HBsAg外周免疫耐受 高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒后形成HBV攜帶小鼠,通過檢測總淋巴細胞比例以及表面分子,發(fā)現(xiàn)HBV攜帶鼠淋巴細胞中CD4+T細胞或CD8+T細胞等比例沒有明顯變化,NK細胞比例以及表面分子(NKG2D、CD69以及NKG2A)均無明顯變化。提示小鼠HBV肝臟感染并未引起全身免疫應(yīng)答能力整體變化。 通過小鼠手術(shù)進行脾內(nèi)注射1μg HBsAg/CFA,發(fā)現(xiàn)正常小鼠均能產(chǎn)生anti-HBs; HBV攜帶鼠(攜帶時間為1周或8周)在HBsAg免疫后,血清中檢測不到anti-HBs。表明肝臟中持續(xù)表達HBV導(dǎo)致小鼠外周免疫系統(tǒng)對HBsAg刺激無應(yīng)答,表現(xiàn)為免疫耐受狀態(tài)。如果pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射1天后進行HBsAg疫苗免疫,小鼠能產(chǎn)生較高滴度的anti-HBs,并能清除小鼠自身的HBV提示針對HBsAg的特異性免疫耐受的形成需要肝臟中HBV的持續(xù)存在,大約需要1周以上時間。在免疫耐受形成前,外周的免疫刺激所形成的免疫應(yīng)答可以清除尚未誘發(fā)免疫耐受或后續(xù)的肝臟HBV感染。同時導(dǎo)致耐受一旦形成,機體將出現(xiàn)全身性HBV無應(yīng)答狀態(tài)。 3.HBV攜帶鼠可將免疫耐受特征轉(zhuǎn)移至正常小鼠 將HBV鼠或?qū)φ帐笃⑴K細胞轉(zhuǎn)輸至正常C57BL/6小鼠中,1天后免疫HBV疫苗,再過1周檢測血清中anti-HBs的滴度。發(fā)現(xiàn)小鼠轉(zhuǎn)輸了HBV鼠脾細胞后產(chǎn)生anti-HBs水平明顯低于對照組。并且隨著轉(zhuǎn)輸?shù)募毎麛?shù)量增多,anti-HBs水平逐漸降低。轉(zhuǎn)輸對照鼠或HBV鼠脾臟細胞后,檢測受體鼠OVA免疫以后血清中anti-OVA IgG并沒有區(qū)別,說明HBV鼠抑制HBsAg的免疫應(yīng)答具有抗原特異性。 4.HBV攜帶鼠中產(chǎn)生具有負調(diào)功能的HBsAg特異性CD4+T細胞轉(zhuǎn)輸對HBV形成免疫應(yīng)答的anti-HBs陽性小鼠脾臟細胞至HBV攜帶Rag1-/-鼠或HBV攜帶鼠,發(fā)現(xiàn)2周內(nèi)供體細胞能明顯清除HBV攜帶Ragl-/-鼠中的HBV,但是無法清除HBV攜帶鼠的HBV, HBsAg幾乎不受影響。進一步將HBV攜帶鼠脾臟細胞與anti-HBs陽性小鼠脾臟細胞1：1混合后轉(zhuǎn)輸至HBV攜帶Rag1-/-鼠,發(fā)現(xiàn)HBV攜帶鼠來源的脾臟細胞能在一定程度上抑制anti-HBs陽性鼠脾臟細胞對HBV的清除能力,但HBV攜帶Rag1-/-鼠脾臟細胞則沒有此抑制作用,提示這種具負調(diào)功能的細胞歸屬淋巴細胞。通過MACS分選HBV攜帶鼠脾臟中CD4+T細胞進行免疫細胞轉(zhuǎn)輸實驗,證明所轉(zhuǎn)輸?shù)肅D4+T細胞與所轉(zhuǎn)輸?shù)钠⑴K總免疫細胞具有相同的抑制效果,提示抑制HBsAg免疫應(yīng)答的負調(diào)細胞是CD4+T細胞。 5.HBV攜帶鼠具負調(diào)功能的CD4+T細胞為Trl樣細胞 流式細胞檢測結(jié)果表明,在HBV鼠肝臟和脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例沒有明顯變化,推測在HBV免疫耐受中Treg細胞不參與重要作用。將分離的小鼠肝臟單個核細胞在體外抗CD3、CD28抗體刺激并培養(yǎng)4天,ELISA檢測發(fā)現(xiàn)HBV攜帶鼠的肝臟單個核細胞產(chǎn)生IL-10和IFN-γ顯著上升,而TGF-β和IL-4則沒有明顯變化,基本符合Trl細胞的細胞因子表型,提示HBV鼠肝臟淋巴細胞中產(chǎn)生了Trl樣細胞。 6. Kupffer細胞在HBV攜帶鼠免疫耐受形成中起關(guān)鍵作用 采用尾靜脈注射Clodronate/liposomes清除Kupffer細胞的實驗表明,Kupffer細胞在HBV形成免疫耐受過程中起著關(guān)鍵作用。Kupffer細胞清除后再高壓注射HBV質(zhì)粒, KC清除組早期(d3)血清中HBsAg明顯高于末清除組,提示正常情況下Kupffer細胞可能參與HBV的清除；隨著時間推移(3-4w), Kupffer細胞清除組血清HBsAg急劇下降,HBV被清除,HBV免疫耐受不能形成,提示Kupffer細胞在免疫耐受形成中起重要作用；Rag1-/-小鼠在清除Kupffer細胞后血清中HBsAg值長期(8w)保持較高的水平,提示Kupffer細胞誘發(fā)機體形成免疫耐受需要獲得性免疫細胞的存在；通過細胞轉(zhuǎn)輸實驗,證明KC清除后HBV攜帶鼠脾臟淋巴細胞不能抑制受者小鼠對HBsAg的免疫應(yīng)答,進一步提示KC與獲得免疫細胞(T細胞和B細胞)的相互作用是HBV攜帶小鼠免疫耐受形成的基礎(chǔ)。 7.HBV攜帶鼠中Tfh和GC B細胞的活化受阻是全身免疫耐受形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 采用流式細胞術(shù)對HBV疫苗免疫后小鼠胭窩淋巴結(jié)免疫細胞進行檢測,發(fā)現(xiàn)HBV攜帶鼠對HBV疫苗沒有免疫應(yīng)答,表現(xiàn)為anti-HBs不能產(chǎn)生,生發(fā)中心不能形成,GC B細胞和Tfh細胞不能活化。這種免疫耐受現(xiàn)象與DC沒有明顯關(guān)系,表現(xiàn)為HBV疫苗免疫后HBV鼠中DC細胞比例與活化均無變化。這些結(jié)果提示在HBV攜帶鼠誘導(dǎo)外周免疫耐受過程中,抗原特異性Trl細胞可能對Tfh細胞或/和GC B細胞進行了負相調(diào)節(jié),從而導(dǎo)致針對HBV疫苗的免疫耐受而無法產(chǎn)生anti-HBs。 結(jié)論：本文通過建立HBV慢性感染小鼠模型,發(fā)現(xiàn)肝臟持續(xù)表達HBV能誘導(dǎo)外周淋巴器官對HBsAg失去免疫應(yīng)答能力。在肝臟免疫耐受誘導(dǎo)外周免疫耐受的機制中,我們發(fā)現(xiàn)Kupffer細胞在誘導(dǎo)HBV特異性的Trl樣負調(diào)細胞的產(chǎn)生中起著非常關(guān)鍵的作用。負調(diào)細胞參與血液循環(huán)至全身淋巴結(jié)和脾臟,通過抑制Tfh細胞和GC B細胞的活化而介導(dǎo)全身免疫耐受的形成。首次闡述了Kupffer細胞、Trl樣細胞以及Tfh細胞三者的相互作用及其免疫耐受形成的機制。
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【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392
【共引文獻】
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本文編號：
2476193
