【摘要】：目的： 本研究觀察含有/缺失人p53結(jié)合位點(diǎn)的NOD8基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白表達(dá)載體在HEK293細(xì)胞的表達(dá)以及含有/缺失人p53結(jié)合位點(diǎn)的NOD8基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白-NOD8融合蛋白重組質(zhì)粒[pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8]轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后, NOD8mRNA和蛋白的表達(dá)；并進(jìn)一步觀察p53抑制劑PFT-α (pifithrinalpha, PFT-α)對(duì)綠色熒光蛋白及NOD8表達(dá)的影響,探討p53結(jié)合位點(diǎn)是否在NOD8基因調(diào)控中發(fā)揮作用。 方法： 利用生物信息學(xué)方法，我們發(fā)現(xiàn)人與黑猩猩的NOD8基因核心啟動(dòng)子區(qū)域相似位置含有p53結(jié)合位點(diǎn)。本研究將含有人p53結(jié)合位點(diǎn)的人NOD8基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白載體pNOD8(760bp)-EGFP及p53結(jié)合位點(diǎn)缺失突變質(zhì)粒mpNOD8(750bp)-EGFP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白；并加入不同濃度的p53抑制劑PFT-α處理HEK293細(xì)胞24h后，將重組質(zhì)粒pNOD8(760bp)-EGFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)，將含有/缺失人P53結(jié)合位點(diǎn)的NOD8基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)綠色熒光蛋白-NOD8融合蛋白的質(zhì)粒[pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8]經(jīng)陽離子聚合物JetPeiT M介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8質(zhì)粒的細(xì)胞中加入不同濃度的p53抑制劑PFT-α，mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組加入90μmol/L的p53抑制劑PFT-α,用RT-PCR和Westren blot方法檢測(cè)NOD8mRNA和蛋白的表達(dá)；此外，利用染色質(zhì)免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation, ChIP）觀察p53是否與NOD8啟動(dòng)子結(jié)合。 結(jié)果: p53結(jié)合位點(diǎn)突變重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)較p53結(jié)合位點(diǎn)未突變的重組質(zhì)粒明顯減弱; PFT-α能夠抑制pNOD8(760bp)-EGFP質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光表達(dá),且呈現(xiàn)劑量依賴性效應(yīng)；ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)p53能與NOD8啟動(dòng)子結(jié)合；pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組的NOD8mRNA表達(dá)顯著高于pEGFP-C2轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。且NOD8mRNA在加入p53抑制劑PFT-α的缺失人的p53結(jié)合位點(diǎn)的mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)加入p53抑制劑PFT-α的pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組NOD8mRNA表達(dá)顯著下降，且呈劑量依賴關(guān)系，其中90μmol/L PFT-α對(duì)NOD8mRNA表達(dá)的抑制作用是最為顯著的（P＜0.01）。與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致，pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組的NOD8蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組pEGFP-C2；加入p53抑制劑PFT-α的mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組和加入p53抑制劑PFT-α的pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組NOD8蛋白的表達(dá)量明顯低于pNOD8(760bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組（P＜0.01）。結(jié)論:(1)p53結(jié)合位點(diǎn)突變重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)較P53結(jié)合位點(diǎn)未突變的重 組質(zhì)粒明顯減弱；說明p53結(jié)合位點(diǎn)能影響NOD8基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率。(2)PFT-α能夠抑制重組質(zhì)粒pNOD8(760bp)-EGFP在HEK293細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)，且呈 現(xiàn)劑量依賴性；(3)ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)p53能與NOD8啟動(dòng)子結(jié)合。(4)NOD8啟動(dòng)子中p53結(jié)合位點(diǎn)具有上調(diào)NOD8mRNA和蛋白表達(dá)的作用，，說明p53結(jié)合位 點(diǎn)在NOD8基因調(diào)控中發(fā)揮了正調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 孫麗萍;胡巢鳳;;NOD突變?cè)谶z傳性疾病中的作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年02期

2 曾琪;蔣宇;胡巢鳳;孫麗萍;陸大祥;;P53結(jié)合位點(diǎn)在NOD8啟動(dòng)子基因克隆調(diào)節(jié)及其對(duì)NOD8基因中的作用[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2010年06期

3 席瓊;胡巢鳳;;NOD樣受體在炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用[J];生命科學(xué);2010年05期

本文編號(hào)：2472642