發(fā)布時(shí)間：2019-05-08 04:47

【摘要】：Notch基因首次發(fā)現(xiàn)于1919年,其突變可造成果蠅翅膀邊緣的一些缺刻(Notchs)而得以命名。目前發(fā)現(xiàn),Notch受體在不同物種之間(從果蠅到人)以及同一物種的不同成員之間都有高度的結(jié)構(gòu)同源性。已知的Notch受體有4種,Notch1、Notch2、Notch3表達(dá)于多種組織器官,其中Notch1的表達(dá)更為廣泛。脊椎動物Notch配體分為Delta-like與Jagged兩類,前者包括delta-like1,delta-like3和delta-like4(又稱Delta1,Delta3,Delta4或Dll1,Dll3,Dll4),后者包括Jagged (Serrate) 1和Jagged(Serrate) 2。這些配體與相同或不同的Notch受體結(jié)合,激活Notch信號通路,參與調(diào)控許多器官、組織、細(xì)胞的生長發(fā)育。 目前認(rèn)為,Notch信號途徑的活化主要采用“三步蛋白質(zhì)水解模式”。無活性的Notch前體從高爾基體中合成后,在向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中,經(jīng)不同蛋白酶體的切割作用,釋放胞內(nèi)段NICD轉(zhuǎn)入核內(nèi)。NICD的RAM區(qū)可以結(jié)合DNA結(jié)合蛋白CSL,在Notch未活化的情況下,CSL蛋白常常作為轉(zhuǎn)錄抑制因子,與SMRT、SHARP、HDAC、CIR等蛋白組成共抑制復(fù)合物來抑制基因轉(zhuǎn)錄。Notch信號除了CSL依賴途徑外,Notch信號還有CSL非依賴途徑,這一途徑包含一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的鋅指蛋白Deltex。NICD與CSL結(jié)合后所產(chǎn)生的效應(yīng)是多樣的,CSL通過與不同的啟動子結(jié)合可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活化或抑制作用。由此可見,Notch在調(diào)節(jié)基因的表達(dá)中可產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用。 Notch信號在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,Notch信號可關(guān)閉神經(jīng)原細(xì)胞bHLH基因的表達(dá)使外胚層細(xì)胞不能繼續(xù)向神經(jīng)細(xì)胞分化,阻止了神經(jīng)元的分化。Notch信號在腫瘤的形成、發(fā)展中也發(fā)揮著不同的作用:一方面,Notch可通過活化一些生長信號,促進(jìn)一些腫瘤的生長。另一方面,目前也有很多研究發(fā)現(xiàn)Notch可通過抑制某些信號抑制腫瘤的生長。綜上所述,Notch信號通路在細(xì)胞增殖分化及凋亡中有重要作用,是許多重要細(xì)胞信號通路的交匯點(diǎn)。目前已經(jīng)有研究表明Notch信號在免疫細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中也起決定性作用,但是,有關(guān)Notch信號與天然免疫的關(guān)系尚有待于深入研究。由此,我們提出的科學(xué)問題是:Notch信號在天然免疫識別與活化中的調(diào)控作用是什么? 對Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的深入研究是近幾年來免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。TLR在識別PAMP中起重要作用,作為一種重要的模式識別受體,主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)表面,構(gòu)成機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線。大多數(shù)TLRs與特定的配體結(jié)合后,通過MyD88依賴途徑即MyD88/IRAK/TRAF6級聯(lián)反應(yīng)來活化MAPK和NF-κB信號通路,促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá),啟動天然免疫。而TLR3和TLR4還存在著MyD88非依賴途徑,即通過接頭分子TRIF或TRAM,最終引起NF-κB的晚期活化和IRF3的核轉(zhuǎn)位,調(diào)控炎性因子和I型干擾素的表達(dá)。TLR不僅啟動天然免疫應(yīng)答,控制炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間,而且調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型,成為連接初始免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的樞紐。TLR信號過度活化或活化不足都會導(dǎo)致機(jī)體功能異常和疾病的發(fā)生,利用TLRs激動劑可增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答,有利于機(jī)體清除入侵病原微生物。而負(fù)相調(diào)控TLR信號通路,可抑制TLRs誘發(fā)的過強(qiáng)免疫應(yīng)答,為感染性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病,以及TLRs介導(dǎo)的免疫紊亂疾病如內(nèi)毒素休克的防治提供新的思路。針對Notch信號在天然免疫識別與活化中的調(diào)控作用是什么的科學(xué)問題,我們想知道Notch信號對TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控究竟具有什么樣的影響? 大量研究表明Notch信號可與其它信號途徑相互作用來調(diào)控免疫細(xì)胞的功能。Notch信號不但可調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞的分化,Notch信號可調(diào)控T細(xì)胞中IFN-γ、IL-4、Il-10等細(xì)胞因子的分泌,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。近年來人們發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化發(fā)育過程中,Notch受體、配體的表達(dá)模式具有時(shí)空性,這提示Notch信號可能參與了抗原遞呈細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞中過表達(dá)Notch1受體可增強(qiáng)IFN-γ誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞STAT1依賴的轉(zhuǎn)錄,上調(diào)IFN-γ調(diào)控因子,抑制ICAM1和MHCII分子的表達(dá),繼而參與調(diào)控一些與抗原遞呈和殺傷相關(guān)基因的表達(dá)。最近有人發(fā)現(xiàn)TLR信號通路可上調(diào)巨噬細(xì)胞表面Notch1的表達(dá),影響Th1/Th2細(xì)胞的分化,調(diào)控免疫反應(yīng); LPS刺激可上調(diào)Raw123細(xì)胞表面的Notch1表達(dá),增強(qiáng)Notch信號的活化。那么,作為可被TLR誘導(dǎo)增加的Notch1是否可反過來調(diào)控TLR信號通路來影響免疫應(yīng)答?如果可以,它又發(fā)揮著怎樣的調(diào)控作用?其具體的調(diào)控機(jī)制如何?對于這些科學(xué)問題,未見研究報(bào)道。本課題針對Notch信號可能參與TLR信號觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生這一設(shè)想進(jìn)行研究,旨在探討Notch信號對TLRs觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響及與TLRs信號通路的交互作用點(diǎn)。 該課題主要分三部分進(jìn)行研究:TLRs觸發(fā)的巨噬細(xì)胞中Notch分子的表達(dá)情況;Notch分子對TLR信號誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響;Notch分子對巨噬細(xì)胞TLRs信號通路的調(diào)控機(jī)制。 1、TLRs觸發(fā)的巨噬細(xì)胞中Notch受體、配體表達(dá)的研究 我們檢測了靜息的巨噬細(xì)胞(Raw264.7細(xì)胞及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)表面Notch受體及配體的表達(dá)以及經(jīng)不同TLR配體(LPS, CpG ODN, poly I:C)刺激后,巨噬細(xì)胞中Notch1-4的表達(dá)變化。熒光定量PCR(Q-PCR)結(jié)果表明,Raw246.7和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均表達(dá)Notch1、Notch2和Notch14,而且Notch1的表達(dá)量最大,Notch 2次之,Notch 4最少,但不表達(dá)Notch3。在巨噬細(xì)胞中Notch的配體均有不同程度的表達(dá),其中,Dll4和Jagged1的表達(dá)豐度高,其他的配體次之。100ng/ml LPS、0.33μM CpG和10 ng/ml poly I:C刺激可顯著上調(diào)Raw246.7細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞中Notch1和Notch2的表達(dá)。 2、Notch信號對TLR信號誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響 研究表明,過表達(dá)Notch1分子的胞內(nèi)區(qū)(NICD)與Notch1配體激活Notch1后對靶細(xì)胞的作用是一致的。鑒于此,我們將組成性活化形式的NICD1、NICD2以及NICD1的PEST結(jié)構(gòu)域缺失的突變(N1-6MT)載體,轉(zhuǎn)染至原代腹腔巨噬細(xì)胞及Raw246.7細(xì)胞中,觀察Notch信號對TLR信號通路的影響。 首先,在原代腹腔巨噬細(xì)胞中研究Notch信號對TLR信號通路的影響。我們分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,體外進(jìn)行培養(yǎng),觀察過表達(dá)組成性活化的NICD1、NICD2和N1-6MT,LPS刺激后細(xì)胞因子的分泌情況。ELISA的結(jié)果表明,過表達(dá)NICD1和NICD2均可增強(qiáng)原代腹腔巨噬細(xì)胞IL-10的分泌,而下調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌。說明Notch信號活化抑制了炎性細(xì)胞因子的分泌,對TLR信號通路可能起負(fù)向調(diào)控作用。而過表達(dá)N1-6MT對以上細(xì)胞因子的分泌效應(yīng)具有相反的效果,說明,NICD1的PEST結(jié)構(gòu)域?qū)ρ仔约?xì)胞因子分泌的抑制效應(yīng)是至關(guān)重要的。 其次,在Raw246.7細(xì)胞中研究了Notch1對TLR信號通路誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。我們將組成性活化形式的NICD1和N1-6MT載體,轉(zhuǎn)染至Raw246.7細(xì)胞中,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)ICN的細(xì)胞株和對照細(xì)胞株;觀察經(jīng)TLR配體刺激后Raw246.7-ICN和Raw246.7對照載體細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌(IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β)的變化。Q-PCR及ELISA的結(jié)果發(fā)現(xiàn):過表達(dá)NICD1可明顯增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的IL-10的分泌,而下調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌。而過表達(dá)N1-6MT,對以上細(xì)胞因子的分泌效應(yīng)正好具有相反效果。 進(jìn)而,在此基礎(chǔ)上,我們利用Notch信號的化學(xué)阻斷劑GSI處理Raw264.7細(xì)胞和小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,觀察不同TLRs配體刺激對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IL-10、IL-6、TNF-α)的變化。結(jié)果顯示:阻斷劑GSI處理巨噬細(xì)胞24h抑制了Notch信號后,再用LPS刺激,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-10的分泌減少,而IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌增加。這一結(jié)果說明,Notch信號被阻斷后,對TLR信號通路誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生被逆轉(zhuǎn),從反面證明了Notch信號活化對TLR信號引起的細(xì)胞因子的調(diào)控作用。 另一方面,我們通過Notch1特異性干擾RNA,檢測Notch1表達(dá)的下調(diào)對LPS誘發(fā)的細(xì)胞因子分泌的影響。我們首先用Q-PCR及Western Blot檢測了其特異性干擾RNA的干擾效率,在Notch1特異性干擾RNA的干擾效率達(dá)70%以上時(shí),在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,干擾Notch1的表達(dá)可下調(diào)LPS誘發(fā)的IL-10的分泌,而上調(diào)了IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的分泌。這一結(jié)果,與化學(xué)阻斷劑GSI的作用效果相一致。 因此,在該部分試驗(yàn)中,無論是Notch1信號的活化還是不同方法進(jìn)行的Notch1信號的阻斷,在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中均得到一致的結(jié)果。這說明Notch1信號確實(shí)參與了LPS誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。 3、Notch對巨噬細(xì)胞TLRs信號通路的調(diào)控機(jī)制 首先,對信號通路進(jìn)行Western Blot檢測。結(jié)果顯示,在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中過表達(dá)NICD1可明顯降低LPS誘導(dǎo)的磷酸化ERK1/2的活化及NF κB轉(zhuǎn)錄活性,而過表達(dá)N1-6MT,可明顯增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的磷酸化ERK1/2的活化及NF κB轉(zhuǎn)錄活性。 我們進(jìn)一步研究了GSI抑制劑及Notch1特異性干擾RNA在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中Notch1信號對LPS誘發(fā)的信號通路的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),GSI抑制劑和Notch1特異性干擾RNA抑制Notch信號后,LPS促發(fā)的ERK1/2的磷酸化明顯增強(qiáng)。 此外,我們還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)N1-6MT質(zhì)粒后,Notch信號失活,抑制IKBα的表達(dá),增強(qiáng)IKBα的磷酸化水平,提示Notch信號活化可抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。 既然,在原代腹腔巨噬細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞中均能觀察到Notch信號對LPS促發(fā)的ERK1/2的磷酸化明顯變化,于是我們用MAPKK抑制劑,即MAPK kinase抑制劑或MEK抑制劑——PD 98059(可以選擇性抑制MEK1,從而抑制ERK1/2的磷酸化和激活),來觀察阻斷p44/42 MAPK的磷酸化后細(xì)胞因子的分泌影響。ELISA的結(jié)果表明,PD 98 059可明顯下調(diào)由Notch1信號活化所造成的細(xì)胞因子的變化。因此,我們認(rèn)為Notch1可能通過ERK1/2信號途徑來參與TLRs信號的調(diào)控。 其次,我們用熒光素酶報(bào)告基因分析來研究Notch和NF-κB通路以及和TNF-α之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,過表達(dá)NICD1、NICD2可以顯著降低由MyD88和TRAF6活化所引起的NF-κB以及TNF-α報(bào)告基因的活性。該結(jié)果說明,過表達(dá)NICD1、NICD2可以抑制NF-κB和TNF-α的轉(zhuǎn)錄活性,而過表達(dá)N1-6MT,可以逆轉(zhuǎn)由NICD1對NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用,說明NICD1的PEST結(jié)構(gòu)域?qū)F-κB的轉(zhuǎn)錄活性以及TNF-α的分泌起到至關(guān)重要的抑制作用。 最后,我們利用免疫共沉淀方法尋找能與Notch1胞內(nèi)段結(jié)合的信號蛋白。在上述的研究中發(fā)現(xiàn)Notch信號可調(diào)控TLRs信號誘發(fā)的細(xì)胞因子的變化,在信號通路方面,Notch可降低LPS促發(fā)的ERK1/2信號的活化,那么Notch信號是怎樣調(diào)控ERK1/2信號通路的呢?它們之間是否有直接的相互作用呢?于是我們利用免疫共沉淀方法尋找能與Notch1胞內(nèi)段結(jié)合的信號蛋白。我們利用免疫沉淀檢測發(fā)現(xiàn):在Notch1的免疫沉淀物中檢測不到ERK1/2,因此,我們認(rèn)為Notch1與TLR信號的交互作用分子并非ERK1/2,可能直接或間接作用于其他靶分子調(diào)控了TLRs介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌。因此,我們認(rèn)為Notch1并不是直接作用于ERK分子,可能通過其它分子起間接作用。 綜上所述,我們的研究表明, Notch1和Notch2分子參與巨噬細(xì)胞中TLR觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控,其通過ERK1/2和/或NF-κB途徑發(fā)揮了調(diào)控作用。其可能的原因有兩種:1、Notch分別通過ERK1/2和NF-κB兩條通路參與調(diào)控TLR觸發(fā)的炎性細(xì)胞因子;2、ERK1/2和NF-κB信號在Notch調(diào)控TLRs的信號通路中,存在先后,這將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行證實(shí)。 另外,對于本文的研究還存在一些需要進(jìn)一步探討的問題: 1、Notch分子通過不同的信號通路,抑制了炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等的分泌,而促進(jìn)了IL-10的分泌;2、Notch分子先促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌,IL-10又進(jìn)一步抑制了IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等促炎細(xì)胞因子的分泌。關(guān)于這一假設(shè),其具體的靶點(diǎn)還未有充分的證據(jù),機(jī)制尚不明確,可以用IL-10的阻斷性抗體進(jìn)行后續(xù)的深入的研究。 總之,這一調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn),有助于深入闡明Notch信號途徑在TLR信號途徑中的作用,并可能為探明不同信號途徑的相互作用在抗感染免疫中的作用提出新證據(jù),該課題豐富了TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制,將為感染、腫瘤等疾病的免疫學(xué)機(jī)理探究以及潛在的新型治療手段的發(fā)現(xiàn)提供新思路。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 劉璇;龍葵總堿誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡及對Notch1影響的研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2012年

2 葛曉紅;LPS刺激對雛雞氣管和肺TLR4的表達(dá)影響研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號：2471632