【摘要】：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在免疫調(diào)節(jié)和維持外周免疫耐受方面起重要作用。由于從供者外周血采集分離到的Tregs的數(shù)量有限,新鮮分離的Tregs需要在體外進(jìn)行擴(kuò)增以獲得臨床應(yīng)用所需的Tregs細(xì)胞數(shù)。已有文獻(xiàn)報道人Tregs可以在體外有效擴(kuò)增,但是擴(kuò)增后的Tregs是否能夠在體內(nèi)有效抑制急性移植物抗宿主病(aGVHD)還不清楚。 本文從臍帶血中分離CD4+CD25+細(xì)胞以及從成人外周血中分離CD4+CD25+CD127-細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增,比較擴(kuò)增后Tregs的免疫抑制功能。臍帶血和外周血Tregs通過兩輪多克隆刺激或第一輪同種異基因抗原刺激加第二輪多克隆刺激進(jìn)行體外擴(kuò)增。兩輪擴(kuò)增結(jié)束后檢測Tregs的表型、分泌的細(xì)胞因子以及抑制功能。采用C57BL/6小鼠骨髓和脾細(xì)胞移植經(jīng)致死性照射的DBA/2小鼠建立aGVHD模型。Tregs治療組用體外擴(kuò)增的臍帶血或外周血Tregs過繼性輸注治療aGVHD模型小鼠。分析比較Tregs治療組和對照組小鼠生存率、體重、GVHD癥狀評分、組織病理學(xué)標(biāo)本、血清細(xì)胞因子、Th細(xì)胞亞群。 臍帶血和外周血Tregs多克隆擴(kuò)增兩輪后平均分別擴(kuò)增1.5×103和1.8×103倍,而采用第一輪同種異基因抗原特異性擴(kuò)增加第二輪多克隆擴(kuò)增后的平均擴(kuò)增倍數(shù)分別是5×102和4.7×102。擴(kuò)增的Tregs高表達(dá)Foxp3、CD39、CTLA-4,低表達(dá)CD127、IL-2、IFN-Y,并且維持了免疫反應(yīng)無能性。采用兩輪多克隆擴(kuò)增的臍帶血Tregs不僅能夠抑制廣譜擴(kuò)增的效應(yīng)T細(xì)胞(Tresp)增殖,而且還能夠抑制HLA抗原不相合的樹突狀細(xì)胞激活的效應(yīng)T細(xì)胞增殖。當(dāng)兩輪多克隆擴(kuò)增的臍帶血或外周血Tregs輸注aGVHD模型小鼠后,分別有87.5%和16.7%的小鼠存活期超過63天,而aGVHD模型小鼠在18天里全部死亡。第7天時擴(kuò)增臍帶血Tregs治療組小鼠體內(nèi)IFN-γ和TNF-a含量顯著低于aGVHD模型小鼠。接著Tregs治療組小鼠體內(nèi)IFN-γ、TNF-α、IL17的含量迅速降低并維持在低水平,而TGF-β的含量持續(xù)上升。小鼠體內(nèi)免疫細(xì)胞亞群的變化與小鼠體內(nèi)血清細(xì)胞因子含量變化是同步的：Th1細(xì)胞百分比從第7天的30%下降到第14天的10%并維持在低水平；小鼠CD4+Foxp3+細(xì)胞(Tregs)比例持續(xù)上升而IL-17陽性細(xì)胞(Th17)則從高水平(約40%)降低到2%以下。在Tregs治療組小鼠體內(nèi),臍帶血Tregs表面的CD39分子能夠抑制小鼠T細(xì)胞的擴(kuò)增,而分泌的TGF-β則誘導(dǎo)Treg/Th17平衡向Tregs方向偏移。 采用兩輪多克隆擴(kuò)增的臍帶血Tregs比外周血Tregs具有更強(qiáng)的免疫抑制功能,能夠通過表達(dá)CD39分子和分泌TGF-β減輕小鼠同種異基因骨髓移植aGVHD癥狀,表明臍帶血Tregs具有臨床應(yīng)用治療aGVHD的潛力。本文建立的從臍帶血和外周血擴(kuò)增Tregs的方法能夠在體外獲得大量的滿足臨床治療需求的多克隆或同種異基因抗原特異性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[Abstract]:Regulatory T cell (Tregs) plays an important role in immunomodulation and maintenance of peripheral immune tolerance. Due to the limited number of Tregs isolated from donor peripheral blood, fresh isolated Tregs needs to be amplified in vitro to obtain the number of Tregs cells needed for clinical application. It has been reported that human Tregs can be effectively amplified in vitro, but it is not clear whether the amplified Tregs can effectively inhibit the (aGVHD) of acute graft-versus-host disease in vivo. CD4 CD25 cells isolated from umbilical cord blood and CD4 CD25 CD127- cells isolated from adult peripheral blood were amplified in vitro to compare the immunosuppressive function of amplified Tregs. Umbilical cord blood and peripheral blood Tregs were amplified in vitro by two rounds of polyclonal stimulation or the first round of allogeneic antigen stimulation plus the second round of polyclonal stimulation. After two rounds of amplification, the phenotype, cytokine secretion and inhibitory function of Tregs were detected. The aGVHD model of C57BL/6 mice was established by transplantation of bone marrow and spleen cells into DBA/2 mice after lethal irradiation. In the Tregs treatment group, aGVHD model mice were treated with expanded umbilical cord blood or peripheral blood Tregs adoptive infusion in vitro. The survival rate, body weight, GVHD symptom score, histopathological specimens, serum cytokines and Th cell subsets in the Tregs treated group and the control group were analyzed and compared. The average amplification of Tregs in cord blood and peripheral blood was 1.5 脳 10 ~ 3 and 1.8 脳 10 ~ 3 times respectively after two rounds of polyclonal amplification, while the average amplification multiple of 5 脳 10 ~ 2 and 4. 7 脳 10 ~ 2 were 5 脳 10 ~ 2 and 4. 7 脳 10 ~ 2 respectively after the first round of alloantigen specific amplification and the second round of polyclonal amplification. The amplified Tregs expressed high expression of Foxp3,CD39,CTLA-4, and low expression of CD127,IL-2,IFN-Y, and maintained the inpotency of immune response. Two rounds of polyclonal amplification of Tregs in cord blood not only inhibited the proliferation of wide-spectrum amplified effector T cells (Tresp), but also inhibited the proliferation of effector T cells activated by dendritic cells with different HLA antigens. When two rounds of polyclonal amplification of cord blood or peripheral blood Tregs were infused into aGVHD model mice, 87.5% and 16.7% of the mice survived for more than 63 days, respectively, while the aGVHD model mice all died within 18 days. On the 7th day, the levels of IFN- 緯 and TNF-a in the Tregs treatment group were significantly lower than those in the aGVHD model mice. Then, the contents of IFN- 緯, TNF- 偽 and IL17 in Tregs group decreased rapidly and maintained at low level, while the content of TGF- 尾 continued to increase. The changes of immune cell subsets in mice coincided with the changes of serum cytokines in mice: the percentage of Th1 cells decreased from 30% on the 7th day to 10% on the 14th day and maintained at a low level. The percentage of (Tregs) in mouse CD4 Foxp3 cells continued to increase, while the percentage of IL-17 positive cells (Th17) decreased from 40% to less than 2%. In the Tregs treatment group, the CD39 molecules on the Tregs surface of cord blood could inhibit the expansion of mouse T cells, while the secreted TGF- 尾 induced the shift of Treg/Th17 balance to Tregs. The cord blood Tregs amplified by two rounds of polyclonal amplification has stronger immunosuppressive function than the peripheral blood Tregs, and can alleviate the aGVHD symptoms of allogeneic bone marrow transplantation in mice by expressing CD39 molecule and secreting TGF- 尾. It is suggested that umbilical cord blood Tregs has the potential of clinical application in the treatment of aGVHD. The method established in this paper to amplify Tregs from cord blood and peripheral blood can obtain a large number of polyclonal or alloantigen-specific regulatory T cells in vitro to meet the needs of clinical treatment.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2465581