發(fā)布時間：2019-04-23 21:22

【摘要】：百日咳是由百日咳鮑特氏菌引起的一種急性呼吸道傳染病,傳染性較強,人群普遍易感,其中尤以嬰幼兒多見。盡管現(xiàn)在世界上絕大多數(shù)國家實施百日咳疫苗的免疫接種多年,但百日咳仍是目前疫苗可預防之疾病中死亡病例的主要原因之一。即便是在疫苗接種覆蓋率很高的發(fā)達國家,近年來百日咳發(fā)病率也有上升的趨勢,值得特別注意的是,已接種疫苗的青少年和成人患百日咳的人數(shù)逐漸增多,但他們的癥狀并不典型,臨床上極易誤診,而且研究表明這些人往往是嬰幼兒百日咳的重要傳染源,因此,百日咳的研究越來越引起人們的重視。本課題通過研究建立檢測和鑒別百日咳鮑特氏菌的多重實時PCR方法;應用多位點可變數(shù)量串聯(lián)重復序列分析(MLVA)和多位點序列分型(MLST)方法分析中國不同時期收集的百日咳鮑特氏菌分離菌株和疫苗株,了解在我國實施百日咳疫苗免疫接種半個世紀以來,流行菌株的基因特征;同時對我國無細胞百日咳疫苗株CS株和現(xiàn)在流行菌株進行全基因組序列測定,在全基因組水平分析菌株之間的差異位點,并以此為基礎分析不同來源和不同時期的菌株基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNP)和插入或缺失(indel)位點的分布,探討細菌分子進化機制。 多重實時PCR檢測百日咳鮑特氏菌方法的研究 成功建立了檢測和鑒定百日咳鮑特氏菌多重實時PCR方法,在同一個反應體系中,能同時擴增3個靶基因,即百日咳鮑特氏菌的百日咳毒素基因啟動子區(qū)域(ptxP)和插入序列(IS)481序列,副百日咳鮑特氏菌的IS1001序列。通過與針對各靶基因的單道實時PCR方法進行平行檢測比較,顯示多重PCR系統(tǒng)中各種靶基因的靈敏度并沒有發(fā)生改變,即在一個反應多重實時PCR反應中,檢測百日咳鮑特氏菌最低限為1-5 CFU,副百日咳鮑特氏菌為1 CFU。多重實時PCR系統(tǒng)中各種靶基因重復性試驗結果顯示批內和批間變異系數(shù)均低于7%,表明建立的檢測方法具有良好的重復性。由于在多重PCR系統(tǒng)中設定了ptxP和IS481兩個靶基因在同一反應體系中檢測分析百日咳鮑特氏菌,改善了方法的特異性,提高了檢測結果的準確性。應用本研究建立的多重實時PCR方法檢測分析以前分離保存的百日咳鮑特氏菌DNA樣品,進一步從分子水平確認這些百日咳桿菌菌株,為下一步百日咳鮑特氏菌基因組多態(tài)性分析的研究對象提供技術保障。 中國百日咳鮑特氏菌分離菌株基因組多態(tài)性研究 本實驗以百日咳鮑特氏菌中兩種重要的表面蛋白基因Prn和tcfA以及百日咳毒素基因的上游啟動子區(qū)域(ptxP)為分子marker,對1950-2007年期間在中國分離的115株菌株和3株疫苗株基因組的多位點序列進行分析,共發(fā)現(xiàn)12種MLST型,在不同時期分離菌株中,均以MLST-1/1/2型(Prn/ptxP/tcfA)為主,其中兩種疫苗株(CS和P3S10株)也屬于MLST-1/1/2型,而另一株疫苗株18530為MLST-1/2/2型。提示在中國目前主要流行菌株的MLST型與疫苗株相似。在中國2000年才發(fā)現(xiàn)MLST-2/3/2型菌株,且出現(xiàn)頻率較低(19.04%)�；贛LVA分析將115株百日咳鮑特氏菌菌株和3株疫苗株分成了46個不同的MLVA型,其中發(fā)現(xiàn)13種新的MLVA型菌株。在中國不同的時期流行著以不同MLVA型為主的菌株;主要流行MLVA型為MLVA-N1、95和33型。與未實施疫苗免疫接種或免疫接種初期的菌株相比較,MLVA實驗結果表明在中國免疫接種百日咳疫苗50多年后,菌株基因多態(tài)性并沒有發(fā)生顯著性的改變。這些分析結果證實在中國當前流行的百日咳鮑特氏菌菌株與其他實施疫苗免疫接種多年和免疫接種覆蓋率高的歐洲國家不同。此外,通過比較MLVA、MLST和PFGE三種分型方法的多態(tài)性指數(shù),統(tǒng)計學分析結果表明MLVA分型方法具有最好的分辨率。通過對中國不同時期百日咳桿菌菌株的MLVA和MLST分析,掌握了我國百日咳分子流行病學的第一手資料,對我國有效預防和控制百日咳的流行以及制定新的百日咳疫苗免疫策略具有指導意義。 無細胞百日咳疫苗株CS的全基因組序列測定及分析 聯(lián)合應用焦磷酸和Sanger測序技術方法對我國無細胞百日咳疫苗生產株CS進行全基因組序列測定,結果顯示該菌株基因組由一條環(huán)形染色體組成,其長度為4,124,236 bp,G+C含量為67.73%,編碼基因(CDS)為3,456個,假基因數(shù)量357個,平均基因大小為982 bp,編碼產物大約含有327個氨基酸。與已發(fā)表的日本分離菌株Tohama I比較基因組學分析結果表明,CS菌株的全基因組序列較Tohama I(4,086,189 bp)大38,047 bp,在CS全基因組中含有兩個特有基因島,即基因島CS-1(22,578 bp)和基因島CS-2(16,690 bp),兩株細菌的CDS同源性高達99.53%。我們校正了Tohama I菌株全基因組序列中存在25個SNP和10個indel位點測序錯誤,CS與Tohama I菌株基因組之間存在301個SNP和40個較小的indel�；谶@些比較基因組學分析結果,估算了百日咳鮑特氏菌基因組的SNP豐度為每13,701個堿基含有1個SNP,表明百日咳鮑特氏菌為最保守的單形細菌之一。將兩株細菌基因組中插入序列和假基因的數(shù)量及其分布的對比分析,進一步證實插入序列在假基因形成以及維持細菌基因組多態(tài)性的作用。與其他鮑特氏菌屬中已完成全基因組測序的支氣管炎鮑特氏菌、副百日咳鮑特氏菌、Bordetella avium和Bordetella petri的比較基因組學分析,鑒定出五種細菌(共6株菌株)全基因組中具有同源性的核心基因1,785個,通過對鮑特氏菌屬的核心基因中進行PAML分析,結果顯示僅有不到1%的基因的可能受到正選擇的影響,表明正選擇可能對百日咳分子進化影響較少。這些資料對于進一步研究百日咳鮑特氏菌及其他鮑特氏菌的分子進化奠定基礎。 百日咳鮑特氏菌的微進化研究 通過檢測分析CS和Tohama I菌株之間差異位點在七株不同時期分離于中國和日本菌株中的分布,發(fā)現(xiàn)新的131個SNP和8個indel。以支氣管炎鮑特氏菌中SNP位點堿基為參考,對比分析百日咳桿菌菌株SNP位點發(fā)生突變的堿基,發(fā)現(xiàn)在百日咳鮑特氏菌基因組中SNP的突變具有GC堿基偏見性。通過SNP的相容性矩陣模型分析表明在百日咳鮑特氏菌核心基因內不相容性低,泛基因中不相容性相對較高,提示在泛基因中,可能受到重組或重復突變導致核苷酸位點發(fā)生變化,從而在細菌適應中發(fā)揮重要作用,這也可能是百日咳鮑特氏菌一種重要的分子進化機制。BP284的重測序分析結果顯示,目前在中國流行菌株基因組中并沒有獲得新的基因,可能以積累SNP的改變在細菌適應性進化過程中起重要作用。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示現(xiàn)階段中國的流行菌株與上世紀50年代分離菌株有較大的進化距離,位于兩個疫苗菌株的外部,其基因組上的改變不僅僅是疫苗壓力造成的適應進化,而是進化分支上的根本改變。詳細分析各菌株基因組中indel事件,建議indel與菌株來源存在有一定相關性的,并發(fā)現(xiàn)各菌株發(fā)生indel事件分布與基于SNP分析系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果相一致。這些結果有利于我們進一步認識百日咳鮑特氏菌全基因組水平上的微進化,同時也為改進百日咳疫苗提供了新的思路。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻】

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1 侯啟明,馬霄,張庶民,趙建榮,梁雅文,駱鵬,呂慧賢,張路民,顧磊,田霖,雷殿良,朱玲,趙雷,唐海文;三組分的無細胞百白破聯(lián)合疫苗安全性和免疫原性研究[J];中國計劃免疫;2003年05期

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本文編號：2463810