【摘要】：骨形態(tài)發(fā)生發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins, BMPs)自被發(fā)現(xiàn)以來，因其多樣的生物學作用受到廣泛重視。BMPs在胚胎的發(fā)生、發(fā)育、組織和細胞的分化、增殖等方面都起著非常重要作用，而最受關注的是其對多能干細胞的骨誘導作用。BMPs是轉(zhuǎn)化生長因子(Transformation growth factor, TGF-β)超家族的成員，目前鑒定分離出20多個成員，其中具有較強骨誘導活性的成員主要包括BMP-2、4、6、7、9。BMP-9（又名GDF-2，growth differentiation factor2）是BMPs中重要的家族成員，有研究顯示BMP-9誘導成骨作用遠強于已允許用于臨床的BMP-2和BMP-7，因而有希望成為更強的骨誘導因子應用于臨床。 骨再生和骨形成是在一個復雜的生物網(wǎng)絡下，多種因子共同參與完成的，目前對BMP-9在骨形成和骨再生過程中的作用以及誘導成骨的機制了解不足，，但基于BMP-9強大的骨誘導能力，迫切希望其能盡快在臨床中發(fā)揮作用。采用重組腺病毒作為載體介導的方法，證實了BMP-9體外的成骨誘導作用和體內(nèi)的異位骨化。盡管重組腺病毒是一種缺陷病毒，理論上不會對宿主細胞造成遺傳性質(zhì)的改變，是一種理想的實驗性表達系統(tǒng)，然而通過其介導應用于臨床還需要一個長期的過程。BMPs免疫原性低，只具有輕微的免疫刺激能力，通常不會引起免疫排斥反應，因此提取純化BMP-9蛋白直接應用到臨床不失為一種簡便快捷的辦法。 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是一種優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng)，超過50%的復雜藥物蛋白都是通過該系統(tǒng)生產(chǎn)的。缺陷型中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary dihydrofolate reductase-deficient CHO-dhfr-）是目前復雜藥物蛋白嚴制和生產(chǎn)的首選表達體系，它是外源真核基因表達的最好宿主細胞，外源蛋白容易在CHO細胞中表達合成，而且易于分泌到培養(yǎng)液中去，表達蛋白的二硫鍵的形成以及蛋白各種形式的折疊與自然合成的蛋白質(zhì)基本一致，BMP-9在翻譯后會經(jīng)過糖基化修飾，以二聚體的形式分泌到胞外。 本研究的目的是：（1）通過PCR技術構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA4/His Max-BMP-9；（2）利用CHO-dhfr-建立穩(wěn)定的真核表達系統(tǒng)，純化出rhBMP-9，并對其進行鑒定；（3）通過刺激培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，檢測rhBMP-9骨誘導活性。 本研究的第一部分以質(zhì)粒padtrack-cmv-bmp9為模板，進行PCR擴增得到hBMP-9cDNA，再將cDNA插入到質(zhì)粒pcDNA4/His Max A中，再通過PCR，酶切及測序鑒定，最終得到真核表達載體pcDNA4/HisMax-hBMP-9。結(jié)果顯示，插入的hBMP-9cDNA沒有發(fā)生堿基突變，讀碼框完全正確，可以進行下一步實驗。 本研究的第二部分是利用脂質(zhì)體將新質(zhì)粒與質(zhì)粒pSV2-dhfr按比例6：1共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞，用含有100μg/ml博來霉素的IMDM進行篩選，不同濃度梯度的MTX逐級加壓培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達rhBMP-9的抗性單克隆株。收集最高表達蛋白的單克隆株培養(yǎng)基上清，經(jīng)His標簽的蛋白純化柱純化，再經(jīng)過Western Blot鑒定得到rhBMP-9。ELISA檢測最高表達rhBMP-9的單克隆株的表達量為1.13μg/24h/106cells；Western Blotting和SDS-PAGE鑒定顯示有兩條明顯的分子量分別約32kD和50kD的條帶。從結(jié)果看，rhBMP-9的表達量并不是很高，rhBMP-9是以二聚體的形式分泌到細胞外，給蛋白純化帶來一定的困難。 第三部分研究是通過得到的rhBMP-9體外刺激培養(yǎng)小鼠間充質(zhì)干細胞C3H10，檢測C3H10的成骨效應。用含100μg/ml的rhBMP-9培養(yǎng)基培養(yǎng)C3H10，分別于7天檢測堿性磷酸酶活性及其染色，20天檢測鈣鹽沉積、骨鈣素和骨橋蛋白的表達。另外，用rhBMP-9刺激培養(yǎng)三天C3H10聯(lián)合醫(yī)用明膠海綿（100μg/ml的rhBMP-9溶解）注射BALB/c裸鼠。以相同濃度的rhBMP-2作為實驗對照。結(jié)果顯示：各項成骨指標rhBMP-9都不及rhBMP-2；體外實驗兩種蛋白都未形成骨塊。 綜上所述，我們能夠利用生物基因工程技術構(gòu)建穩(wěn)定的真核表達系統(tǒng)，而且利用特定的蛋白標簽可以將rhBMP-9純化出來且表現(xiàn)出一定的生物學活性。然而蛋白的表達量和骨誘導活性并沒有達到預期，主要原因可能是篩選的單克隆株并不十分穩(wěn)定，在多次傳代后降低了蛋白的表達；另外，rhBMP-9在CHO-dhfr-表達后形成了二聚體，在分泌過程中會以多種形式存在，純化過程中導致部分有活性的rhBMP-9丟失。盡管實驗結(jié)果稍顯遺憾，但該研究對rhBMP-9盡快應用臨床提供了新的途徑，因此，能否通過外源性基因的干擾，獲得更加穩(wěn)定高表達系統(tǒng)，利用新的方法純化出有活性蛋白值得我們進一步思考和研究。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 董文博;陳洪棟;郝建國;李紅民;;用于藥用蛋白生產(chǎn)的外源表達系統(tǒng)[J];基因組學與應用生物學;2009年04期

2 趙娜;劉鳳玲;蔡學敏;張麗蕓;陳政良;;MBL突變體在CHO細胞中表達及其產(chǎn)物分析[J];現(xiàn)代免疫學;2007年03期

3 龍乾發(fā);劉衛(wèi)平;玉石;劉陽;韓蕊;王孝安;李娟;;體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向GABA能神經(jīng)元分化[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2009年06期

4 宋小紅;于婷;李冰;付玲;侯利華;陳薇;;促進CHO細胞生長及其產(chǎn)物hNGF表達的培養(yǎng)條件的初步研究[J];中國生物工程雜志;2010年04期

5 黃芬;安小平;李存;何彰華;張寶中;米志強;王娟;童貽剛;;過表達熱休克蛋白70提高CHO細胞表達抗體的能力[J];中國生物工程雜志;2011年09期

6 喬媛媛;陳宇萍;;單鏈抗體及其醫(yī)學應用[J];中國生物制品學雜志;2009年01期

7 潘勇兵;張愛華;胡迪超;閉蘭;楊曉明;;抗CD25人鼠嵌合抗體基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與瞬時表達[J];中國生物制品學雜志;2010年02期

8 陳奮則;王妍;朱一松;高仁均;;干擾素α2b基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及表達[J];中國生物制品學雜志;2010年11期

9 何太平;楊波;譚曉晶;唐菁燕;雷韜;宋春雷;聶艷桃;徐瓏;;重組復雜蛋白快速表達體系的建立[J];中國生物制品學雜志;2011年11期

10 嚴敏;孫茂盛;王文舉;謝天宏;李太華;李鴻鈞;;表達甲型H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶的重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫原性[J];中國生物制品學雜志;2011年11期

本文編號：2463417