【摘要】：目的:探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的高效誘導(dǎo)體系,為應(yīng)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高效向成骨細(xì)胞分化提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。 方法:應(yīng)用密度梯度離心法分離和培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,采用MTT法對(duì)體外擴(kuò)增的第一代、第二代細(xì)胞描繪生長曲線,觀察細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的動(dòng)態(tài)增殖變化。第二代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜上抗原CD14、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表達(dá)情況,鑒定是否為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。按照培養(yǎng)液中地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C的不同濃度分為4組,并設(shè)立空白對(duì)照組。誘導(dǎo)1組為地塞米松1×10~(-9) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-3) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L;誘導(dǎo)2組為地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-3) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L;誘導(dǎo)3組為地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-2) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L;誘導(dǎo)4組為地塞米松1×10-7 mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-2) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L。加入上述藥物誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化,培養(yǎng)10天后應(yīng)用堿性磷酸酶鈣鈷法染色檢測(cè)其分化的成骨細(xì)胞的成骨情況,篩選誘導(dǎo)效率最高的誘導(dǎo)體系。 結(jié)果:在細(xì)胞接種后1～3天,第一代細(xì)胞數(shù)量下降,接著在第4～10天細(xì)胞生長進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,然后進(jìn)入平臺(tái)期。第二代細(xì)胞在接種后1～2天,細(xì)胞數(shù)量下降,第3～10天細(xì)胞生長進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,然后進(jìn)入平臺(tái)期。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)的第二代細(xì)胞細(xì)胞膜表面標(biāo)志抗原為CD44、CD90、CD105陽性,CD14、CD34、CD45陰性,說明培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。對(duì)第二代細(xì)胞加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10天后應(yīng)用堿性磷酸酶鈣鈷法染色,分析其積分光密度值為:誘導(dǎo)1組積分光密度值均數(shù)為634500.14;誘導(dǎo)2組積分光密度值均數(shù)為716254.91;誘導(dǎo)3組積分光密度值均數(shù)為808213.05;誘導(dǎo)4組積分光密度值為577479.49;空白對(duì)照組積分光密度值均數(shù)為177411.99。經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn),4個(gè)誘導(dǎo)組分別與空白對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4個(gè)誘導(dǎo)組之間比較為誘導(dǎo)3組與其它3個(gè)誘導(dǎo)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:采用密度梯度離心分離和培養(yǎng)的方法,可以獲得較純的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;經(jīng)檢測(cè)特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105證實(shí)培養(yǎng)的第二代細(xì)胞為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。研究結(jié)果表明由地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-2) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L組成的誘導(dǎo)體系,誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的效率最高。 目的:研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在本研究所采用的體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,細(xì)胞是否有致瘤性,以及染色體核型是否有異常的變化,分析人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的生物安全性。 方法:按照地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C的不同濃度組合分為4組,并設(shè)立陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組。誘導(dǎo)1組為地塞米松1×10~(-9) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-3) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L;誘導(dǎo)2組為地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-3) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L;誘導(dǎo)3組為地塞米松1×10~(-8) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-2) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L;誘導(dǎo)4組為地塞米松1×10~(-7) mol/L、β-甘油磷酸鈉1×10~(-2) mol/L、維生素C 3×10~(-4) mol/L;陰性對(duì)照組為人真皮成纖維細(xì)胞接種在裸小鼠皮下;陽性對(duì)照組為CNE~(-2)細(xì)胞接種在裸小鼠皮下。MSCs第3次傳代培養(yǎng)10天后,按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后,繼續(xù)培養(yǎng)10天后,收獲細(xì)胞并接種在裸小鼠的皮下,10周后觀察接種部位是否有可疑腫瘤或結(jié)節(jié)。應(yīng)用染色體G顯帶處理方法分析誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)各組人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的核型,觀察誘導(dǎo)后的染色體是否發(fā)生倒位、易位、缺失、復(fù)制或融合等畸變。 結(jié)果:4個(gè)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組均未發(fā)現(xiàn)接種部位有結(jié)節(jié)或腫瘤,接種部位組織HE染色,可見皮膚、皮下、肌肉結(jié)構(gòu)層次清晰,未見明顯異常。陰性對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)接種部位有結(jié)節(jié)或腫瘤,接種部位組織HE染色,可見皮膚、皮下、肌肉結(jié)構(gòu)層次清晰,未見明顯異常。陽性對(duì)照組接種后第2天可見小白點(diǎn),隨著時(shí)間的推移呈進(jìn)行性增大,2周時(shí)可見接種部位瘤體組織直徑約1cm,瘤體組織HE染色可見明顯癌巢。4個(gè)誘導(dǎo)組的細(xì)胞按染色體G顯帶核型制片,參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制,用染色體圖像分析儀進(jìn)行核型分析,核型正常,無染色體的倒位、易位、缺失、復(fù)制或融合等畸變。 結(jié)論:本研究采用的不同濃度的地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C組成的誘導(dǎo)體系體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,經(jīng)誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其分化的成骨細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)致瘤性,其染色體G顯帶核型正常,符合作為骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)用的關(guān)于生物安全性的有關(guān)要求。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 黎婷;劉愛良;孫晉虎;李帥;呂中靜;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨誘導(dǎo)分化移植修復(fù)腭裂骨缺損的初步臨床研究[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2012年07期

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本文編號(hào)：2457747