【摘要】：肺炎鏈球菌是引起腦膜炎、敗血癥、肺炎等疾病的主要病原菌,全球每天由于這種病菌而死亡的人數(shù)達(dá)到了約3700人,其中大多數(shù)為抵抗力較弱的兒童。并且由于環(huán)境的污染,抗生素的大量不良使用等原因已經(jīng)使得肺炎鏈球菌對(duì)傳統(tǒng)抗菌藥物的抗性增強(qiáng),所以尋找新的靶標(biāo)及抗生素意義深遠(yuǎn)。 類異戊二烯在自然界中非常常見,它具有很多重要的生物功能,所以研究類異戊二烯的形成途徑,尋找合適的靶標(biāo)吸引了很多研究者的注意。在生物體內(nèi),類異戊二烯的生成有兩種途徑,一種為甲羥戊酸途徑,另外一種為非甲羥戊酸途徑。在肺炎鏈球菌中,異戊二烯的合成主要采用甲羥戊酸途徑。我們選取的靶標(biāo)是甲羥戊酸途徑中的3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR),功能是催化3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原生成甲羥戊酸,是甲羥戊酸形成過程的限速酶。我們的研究主要從下面幾個(gè)方面進(jìn)行： (1)根據(jù)已有的假單胞菌的HMGR晶體結(jié)構(gòu),同源模建出肺炎鏈球菌的晶體結(jié)構(gòu)用于篩選可能的靶標(biāo)化合物,我們篩選出了D7S系列化合物和LH系列化合物。 (2)對(duì)虛擬篩選出來的化合物進(jìn)行生物活性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明D7S系列的化合物對(duì)HMGR的抑制作用比較明顯,IC50在幾十個(gè)微摩爾。抑制效果最好的化合物D7S21的IC50為11.3μM. (3)為了找出抑制效果較好的化合物的結(jié)合位點(diǎn),我們將化合物對(duì)接到模建的蛋白結(jié)構(gòu)中。對(duì)接的結(jié)果顯示化合物與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是K263、N212、H378。這幾個(gè)位點(diǎn)中H378是重要的催化殘基,而K263即使重要的催化位點(diǎn)也是重要的結(jié)合位點(diǎn),而N212A是輔因子NADPH的重要結(jié)合位點(diǎn),所以我們推測(cè)原因是化合物占據(jù)了部分底物和輔因子的活性位點(diǎn),阻礙了底物和輔因子與酶的結(jié)合從而抑制酶的活性。我們采用了結(jié)合位點(diǎn)突變體酶活測(cè)試和突變體蛋白熒光猝滅兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)接的結(jié)果。 (4)結(jié)合位點(diǎn)的突變體中有活性的只有Q382A和結(jié)合位點(diǎn)N212D有活性。Q382的主要作用是穩(wěn)定既是重要催化位點(diǎn)也是化合物重要結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基H378,但是自身與化合物并沒有直接相互作用。N212是輔因子NADPH的重要的結(jié)合位點(diǎn),同時(shí)也是化合物的結(jié)合位點(diǎn),突變成A則失去活性,所以突變成D,保留一部分活性和結(jié)合能力。測(cè)試結(jié)果表明相比較于野生型,作為代表的化合物D7S21和D7S14對(duì)Q382A和N212D的抑制作用有所減弱,對(duì)Q382A的IC50增大了2倍,對(duì)N212D的IC5o增大了3倍。 (5)由于其它一些結(jié)合位點(diǎn)的突變體,如K263A、H378A、N212A都失去生物活性,所以我們用熒光猝滅的方法加以驗(yàn)證。熒光猝滅結(jié)果顯示突變體與化合物的結(jié)合能力均比野生型要差,突變體與化合物的結(jié)合常數(shù)都大幅減小,其中結(jié)合能力最差的是Q382A和K263A,結(jié)合常數(shù)從野生型的14×104M-1降到了1.3×104和0.95×104M-1,降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。 由酶活和熒光的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示N212、H378、K263是化合物的重要結(jié)合位點(diǎn),抑制劑很有可能是通過與這些結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合而阻礙底物和輔因子的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)抑制酶活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2457251