【摘要】：肺炎鏈球菌是引起腦膜炎、敗血癥、肺炎等疾病的主要病原菌,全球每天由于這種病菌而死亡的人數(shù)達到了約3700人,其中大多數(shù)為抵抗力較弱的兒童。并且由于環(huán)境的污染,抗生素的大量不良使用等原因已經(jīng)使得肺炎鏈球菌對傳統(tǒng)抗菌藥物的抗性增強,所以尋找新的靶標(biāo)及抗生素意義深遠。 類異戊二烯在自然界中非常常見,它具有很多重要的生物功能,所以研究類異戊二烯的形成途徑,尋找合適的靶標(biāo)吸引了很多研究者的注意。在生物體內(nèi),類異戊二烯的生成有兩種途徑,一種為甲羥戊酸途徑,另外一種為非甲羥戊酸途徑。在肺炎鏈球菌中,異戊二烯的合成主要采用甲羥戊酸途徑。我們選取的靶標(biāo)是甲羥戊酸途徑中的3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR),功能是催化3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原生成甲羥戊酸,是甲羥戊酸形成過程的限速酶。我們的研究主要從下面幾個方面進行： (1)根據(jù)已有的假單胞菌的HMGR晶體結(jié)構(gòu),同源模建出肺炎鏈球菌的晶體結(jié)構(gòu)用于篩選可能的靶標(biāo)化合物,我們篩選出了D7S系列化合物和LH系列化合物。 (2)對虛擬篩選出來的化合物進行生物活性測試。實驗結(jié)果證明D7S系列的化合物對HMGR的抑制作用比較明顯,IC50在幾十個微摩爾。抑制效果最好的化合物D7S21的IC50為11.3μM. (3)為了找出抑制效果較好的化合物的結(jié)合位點,我們將化合物對接到模建的蛋白結(jié)構(gòu)中。對接的結(jié)果顯示化合物與蛋白的結(jié)合位點是K263、N212、H378。這幾個位點中H378是重要的催化殘基,而K263即使重要的催化位點也是重要的結(jié)合位點,而N212A是輔因子NADPH的重要結(jié)合位點,所以我們推測原因是化合物占據(jù)了部分底物和輔因子的活性位點,阻礙了底物和輔因子與酶的結(jié)合從而抑制酶的活性。我們采用了結(jié)合位點突變體酶活測試和突變體蛋白熒光猝滅兩種方法進行驗證對接的結(jié)果。 (4)結(jié)合位點的突變體中有活性的只有Q382A和結(jié)合位點N212D有活性。Q382的主要作用是穩(wěn)定既是重要催化位點也是化合物重要結(jié)合位點的氨基酸殘基H378,但是自身與化合物并沒有直接相互作用。N212是輔因子NADPH的重要的結(jié)合位點,同時也是化合物的結(jié)合位點,突變成A則失去活性,所以突變成D,保留一部分活性和結(jié)合能力。測試結(jié)果表明相比較于野生型,作為代表的化合物D7S21和D7S14對Q382A和N212D的抑制作用有所減弱,對Q382A的IC50增大了2倍,對N212D的IC5o增大了3倍。 (5)由于其它一些結(jié)合位點的突變體,如K263A、H378A、N212A都失去生物活性,所以我們用熒光猝滅的方法加以驗證。熒光猝滅結(jié)果顯示突變體與化合物的結(jié)合能力均比野生型要差,突變體與化合物的結(jié)合常數(shù)都大幅減小,其中結(jié)合能力最差的是Q382A和K263A,結(jié)合常數(shù)從野生型的14×104M-1降到了1.3×104和0.95×104M-1,降低了一個數(shù)量級。 由酶活和熒光的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示N212、H378、K263是化合物的重要結(jié)合位點,抑制劑很有可能是通過與這些結(jié)合位點的結(jié)合而阻礙底物和輔因子的結(jié)合而實現(xiàn)抑制酶活。
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【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：2457251