發(fā)布時間：2019-04-09 13:40

【摘要】：【目的】 前期研究表明，人纖維介素（human fibrinogen like protein2prothrombinase,fgl2）是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等的關(guān)鍵因素，本研究針對這一基因，構(gòu)建重組hfgl2的微小RNA（miRNA）腺病毒（Adenovirus，Ad）表達(dá)質(zhì)粒（pAd-hfgl2-miRNA），并進(jìn)行包裝、擴(kuò)增為重組hfgl2-miRNA腺病毒（Ad-hfgl2-miRNA）。研究重組Ad-hfgl2-miRNA在細(xì)胞水平對hfgl2基因表達(dá)的抑制作用，及其在裸小鼠皮下移植瘤肝癌模型中體內(nèi)hfgl2表達(dá)的分布情況。 【方法】 1.利用miRNA設(shè)計軟件，針對hfgl2基因分別設(shè)計3對pre-miRNA序列，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒， pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1、2、3和非相關(guān)干擾質(zhì)粒，然后將其分別與pcDNA3.1-hfgl2共轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞（293T細(xì)胞），通過Real-time PCR和western-blot檢測在細(xì)胞水平的干預(yù)效應(yīng)。 2.參照Invitrogen公司的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)試劑盒說明書，使用GATEWAY技術(shù)將pcDNA6.2-hfgl2-miRNA1表達(dá)質(zhì)粒重組成pAd-hfgl2-miRNA腺病毒表達(dá)質(zhì)粒。然后進(jìn)行病毒包裝、擴(kuò)增，制備重組hfg12-miRNA腺病毒顆粒。 3.使用病毒DNA小提試劑盒，PCR擴(kuò)增片段，鑒定目的基因。 4.使用TCID50法測定重組Ad-hfgl2-miRNA的滴度。 5.確定腺病毒感染HCCLM6細(xì)胞的最適感染復(fù)數(shù)MOI，并共培養(yǎng)，使用Realtime PCR和Western-Blot檢測其抑制作用，使用PKH26法以流式細(xì)胞技術(shù)檢測hfgl2干擾后的HCCLM6細(xì)胞增殖能力的改變；使用CCK-8法測定半數(shù)抑制濃度。 6.瘤內(nèi)注射1×109IU帶有綠色熒光蛋白的重組Ad-hfgl2-miRNA，使用活體熒光成像儀連續(xù)拍照，直至熒光消失。 7.使用Realtime PCR檢測瘤內(nèi)注射1×10~9IU重組Ad-hfgl2-miRNA后第1、3、7、9、11、15、19、24天，裸小鼠人肝癌模型的心、肝、脾、肺、腎、小腸及荷瘤的hfgl2-miRNA表達(dá)情況。 8.采集瘤內(nèi)注射1×10~9IU重組Ad-irrelevant-miRNA后第1、3、7、11、24天裸小鼠人肝癌模型的眼球血，采集有荷瘤但未進(jìn)行任何干預(yù)的裸小鼠的眼球血及無荷瘤的正常裸小鼠的眼球血，一并行谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH-L）、尿素氮（BUN）、血肌酐（CR）檢測。重組Ad-irrelevant-miRNA干預(yù)裸小鼠的心、肝組織用4％的甲醛固定，行H.E.染色，觀察組織病理學(xué)改變。 【結(jié)果】 1.成功構(gòu)建重組人fg12微小RNA腺病毒表達(dá)載體，合成、擴(kuò)增重組人fg12微小RNA腺病毒。 2.在細(xì)胞水平水平，重組Ad-hfgl2-miRNA對hfgl2表達(dá)具有明顯抑制作用，IC50=600MOI。 3.活體熒光成像儀可觀察到注射后第1天即有熒光表達(dá)，以第3、4天表達(dá)最強，第7、8天消失。 4. QRT-realtime PCR可在裸小鼠心、肝、脾、肺、腎、小腸及給藥部位荷瘤檢測到hfgl2-miRNA，并維持停藥后第24天。心、脾、肺、腎、荷瘤組織中的mRNA表達(dá)水平，以給藥后第7天為表達(dá)高峰，組間無明顯差異，P＞0.05。在肝臟中的mRNA水平，第3天為表達(dá)高峰，較空白對照組、其他時間點明顯增高，具有顯著性差異P＜0.05。在小腸中的mRNA水平，第7天為表達(dá)高峰，較空白對照組、其他時間點明顯增高，具有顯著性差異P＜0.01。第11天表達(dá)水平較空白對照組明顯增高，，兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05，其他時間點與空白對照組無明顯差異。 5.血生化檢測：Ad-irrelevant-miRNA注射后，第1、3、7、11、24天，ALT、AST、CK、LDH-L可觀察到增高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)異常，P＞0.05。BUN、CR基本正常。非相關(guān)對照組、空白有荷瘤對照組與空白無荷瘤對照組之間無顯著性差異，P＞0.05。心、肝組織HE染色，顯微鏡下未見實質(zhì)細(xì)胞明顯損傷性改變（如：細(xì)胞大量壞死，明顯出血和炎癥細(xì)胞浸潤等）。 【結(jié)論】 1.重組人fg12微小RNA腺病毒表達(dá)載體的成功構(gòu)建，為研究miRNA對基因治療提供應(yīng)用基礎(chǔ)。 2.重組人fgl2微小RNA腺病毒注射液在體外可有效抑制hfgl2的表達(dá)及增殖作用，為肝癌模型體內(nèi)實驗提供實驗基礎(chǔ)。 3. hfgl2在模型中廣泛分布，重組人fgl2微小RNA腺病毒注射液在體內(nèi)無明顯毒性作用，為針對hfgl2這一關(guān)鍵靶基因的肝癌治療的安全性研究提供了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R3416;R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳濤;石寶晨;陳潤生;;RNA干涉現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與研究進(jìn)展——2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎簡介[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2006年10期

本文編號：2455228