【摘要】：人CD83分子是I型免疫球蛋白超家族(IgSF)糖蛋白,由205個(gè)氨基酸組成,分子量約45kD,包括胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段三部分,其中胞外段128個(gè)氨基酸,含一個(gè)V型Ig樣功能區(qū)并被高度的糖基化;胞內(nèi)段僅有39個(gè)氨基酸,且不含酪氨酸,沒有相應(yīng)免疫受體酪氨酸激活/抑制基序(ITAM/ITIM)。小鼠CD83全長(zhǎng)196個(gè)氨基酸(胞外段133個(gè)),與人有63%同源性。CD83受體尚未鑒定,但可在單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞(DC)上檢測(cè)到該潛在的未知受體表達(dá)。 CD83編碼基因位于6號(hào)染色體短臂p23帶。由5個(gè)外顯子組成,第1個(gè)外顯子編碼信號(hào)肽,第2和3個(gè)編碼胞外段(其中外顯子3主要編碼V型Ig樣結(jié)構(gòu)域),外顯子4和5分別編碼跨膜區(qū)和胞內(nèi)段。序列比對(duì)表明CD83胞外段含5個(gè)半胱氨酸殘基,其中第1~4個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵,與蛋白構(gòu)象形成有關(guān)。靠近跨膜區(qū)的第5個(gè)半胱氨酸比較保守,可通過分子間二硫鍵形成CD83同源二聚體。 CD83分子伴隨MHC II類分子誘導(dǎo)表達(dá)在成熟DC表面,因此曾被認(rèn)為是DC成熟的標(biāo)志分子之一,但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該分子亦可表達(dá)在活化的T與B細(xì)胞、胸腺基質(zhì)細(xì)胞(TEC)以及一些腫瘤細(xì)胞表面。在中樞免疫器官胸腺中,CD83對(duì)CD4+ T細(xì)胞發(fā)育具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,而在外周免疫系統(tǒng)中,表達(dá)在細(xì)胞表面的膜型CD83分子(membrane CD83,mCD83)的功能尚待闡明。但是非常有意義的是,大量體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)從細(xì)胞表面脫落或體外重組等以可溶性形式存在CD83(solubleCD83,sCD83)對(duì)DC介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖具有明顯的免疫抑制作用,繼而的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)重組CD83蛋白對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)以及同種異型皮膚移植急性排斥反應(yīng)具有很好的預(yù)防或治療作用。因此,sCD83發(fā)揮效應(yīng)的作用模式與分子機(jī)制引起高度關(guān)注。 鑒此,在本研究中,我們首先制備了人CD83-Ig重組蛋白以及鼠抗人CD83單克隆抗體,并利用重組蛋白分析了sCD83分子對(duì)T細(xì)胞的體外作用。結(jié)果表明CD83-Ig以劑量依賴方式有效抑制激發(fā)型CD3單抗刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖以及IL-2與IFN-γ分泌,對(duì)純化外周血T細(xì)胞則幾乎沒有作用,中文摘要人CD83分子單克隆抗體與重組蛋白制備及其抑制T細(xì)胞功能的機(jī)制研究但CD83-Ig刺激的單核細(xì)胞培養(yǎng)上清具有對(duì)T細(xì)胞的有效抑制效應(yīng)。通過進(jìn)一步對(duì)上清中的細(xì)胞因子分析和特異性抑制劑阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí),CD83-Ig與單核細(xì)胞上的未知受體結(jié)合后可介導(dǎo)PGE2上調(diào)表達(dá)從而發(fā)揮對(duì)T細(xì)胞的抑制效應(yīng)。因此,本研究揭示了CD83分子通過上調(diào)PGE2抑制T細(xì)胞效應(yīng)功能的免疫調(diào)控新機(jī)制。本論文共分為兩個(gè)部分。 1.人CD83-Ig融合蛋白及鼠抗人CD83單克隆抗體的制備與生物特性鑒定 采用重疊PCR(overlap extension PCR)技術(shù)構(gòu)建CD83-Ig融合蛋白,包含人CD83胞外段(1~128位氨基酸)和人IgG1的Fc段。在Fc段鉸鏈區(qū)編碼序列第326位和335位有2個(gè)位點(diǎn)誘變(site-directed mutagenesis),使原本編碼的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸從而阻止在鉸鏈區(qū)形成二硫鍵,保持重組蛋白為單鏈狀態(tài)。重組pIRES2-EGFP-CD83-Ig載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞株后篩選獲得陽(yáng)性克隆1C4。無血清培養(yǎng)基大量培養(yǎng)1C4后收集上清,經(jīng)Protein G親和層析純化獲得重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定CD83-Ig分子量為54kD左右,點(diǎn)雜交(Dot-blot)證實(shí)重組蛋白可被特異性CD83單抗識(shí)別,而且,CD83-Ig與CD83單抗預(yù)先孵育可以劑量依賴方式阻斷后者與CD83轉(zhuǎn)基因細(xì)胞結(jié)合,提示該重組蛋白具有良好的生物學(xué)特性,可用于后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。 以高表達(dá)膜型CD83分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L929/CD83為免疫原,采用經(jīng)典雜交瘤技術(shù),經(jīng)反復(fù)篩選及克隆化培養(yǎng),獲得一株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD83單抗的雜交瘤細(xì)胞株,命名為1E11�？焖俣ㄐ栽嚰埛ǚ治�1E11重鏈為IgG1,輕鏈為κ鏈。雜交瘤經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng),液氮凍存,復(fù)蘇后生長(zhǎng)良好,抗體分泌性能穩(wěn)定。染色體數(shù)目分析顯示,雜交瘤細(xì)胞株的染色體在100條以上。采用本室建立的腹水誘生法制備單抗,腹水形成陽(yáng)性率約為80%以上,腹水的收獲量平均為3 mL/只。經(jīng)Protein G親和層析柱分離純化,腹水中抗體蛋白的得率為1.5~2.0 mg/mL。純化抗體經(jīng)Dot-blot鑒定表明可與重組CD83-Ig特異性結(jié)合并與商品化CD83單抗HB15e競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一表位。由此表明,1E11為特異性抗人CD83的單克隆抗體。 2. CD83-Ig刺激單核細(xì)胞分泌PGE2介導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞的抑制效應(yīng) (1)體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示,重組CD83-Ig蛋白以劑量依賴方式抑制激發(fā)型CD3單抗誘導(dǎo)的PBMC增殖和IL-2與INF-γ分泌:0.5,1,2,5和10μg/mL重組CD83蛋白對(duì)PBMC增殖的抑制率分別達(dá)到84.7%,72.6%,53.7%,47.8%和43.3%;10μg/mL重組蛋白導(dǎo)致其IL-2分泌減少約4~5倍而IFN-γ分泌減少了60%~70%。與此形成鮮明對(duì)比的是,CD83-Ig對(duì)激發(fā)型CD3和CD28單抗聯(lián)合刺激的純化T細(xì)胞的增殖并無明顯的抑制效應(yīng)。(2)利用重組蛋白對(duì)未知的CD83受體表達(dá)分析表明,CD83-Ig主要結(jié)合至CD14+單核細(xì)胞卻幾乎不與新鮮乃至經(jīng)激發(fā)型CD3和CD28刺激1到3天的T細(xì)胞結(jié)合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示,可溶性CD83-Ig刺激單核細(xì)胞上清經(jīng)離心去除細(xì)胞成分后用來培養(yǎng)激發(fā)型CD3與CD28單抗聯(lián)合刺激的T細(xì)胞時(shí),可觀察到約50%的T細(xì)胞增殖抑制以及大約75%和45%的IL-2和IFN-γ分泌抑制。(3)對(duì)重組蛋白刺激的單核細(xì)胞上清分析表明在目前已知的與單核細(xì)胞有關(guān)的抑制性因子中,PGE2可被CD83-Ig介導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。western blotting分析表明單核細(xì)胞內(nèi)特異性催化PGE2合成的COX-2亦可被CD83-Ig介導(dǎo)上調(diào)表達(dá)并與PGE2分泌呈基本一致的時(shí)間動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。最后,COX-2選擇性抑制劑NS-398幾乎完全逆轉(zhuǎn)CD83-Ig介導(dǎo)的對(duì)PBMC的抑制效應(yīng)以及CD83-Ig刺激的單核細(xì)胞上清對(duì)T細(xì)胞的抑制功能。 綜上所述,本研究成功地構(gòu)建了重組pIRES2-EGFP-CD83-Ig載體,篩選了穩(wěn)定表達(dá)人CD83-Ig蛋白CHO細(xì)胞株并制備了鼠抗人CD83單抗1E11,這為進(jìn)一步探討CD83分子表達(dá)與功能奠定了厚實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。繼而的研究發(fā)現(xiàn)重組CD83-Ig通過刺激單核細(xì)胞分泌PGE2發(fā)揮對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)。在此模式中,sCD83作為負(fù)向調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞功能分子,在抗原遞呈細(xì)胞啟動(dòng)的特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。本研究將為更好地理解CD83分子功能及將可溶性CD83作為生物因子用于免疫干預(yù)提供有價(jià)值的理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 高超;仲維學(xué);鄭舒丹;陳禮文;朱一蓓;張學(xué)光;;一株識(shí)別CD83單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年10期

2 邱玉華，張學(xué)光，謝煒，，朱學(xué)東;一種顯著提高小鼠生產(chǎn)單抗腹水產(chǎn)量的新方法[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;1995年06期

本文編號(hào)：2453172