【摘要】：腸道菌群是人體內(nèi)最復(fù)雜的共生微生物生態(tài)系統(tǒng),無論是健康或疾病狀態(tài)下,人體生理代謝都不可避免地受到腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。 Feacalibacterium prausnitzii是人腸道中數(shù)量最占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌之一,占細(xì)菌總數(shù)的7%以上,并在人群中廣泛分布。腸道細(xì)菌F. prausnitzii具有重要的生理功能:能夠?yàn)槟c上皮細(xì)胞提供能量;可以影響宿主多個(gè)代謝通路;可能通過甲胺類物質(zhì)的代謝與胰島素抵抗相關(guān);具有抗腸道炎癥的特性。但是該種菌嚴(yán)格厭氧且難于培養(yǎng),因此,使用分子方法對(duì)該細(xì)菌在中國(guó)人群中的數(shù)量和組成進(jìn)行分析,對(duì)解析F. prausnitzii與人體健康和疾病的關(guān)系具有重要的意義。 本研究首先比較3對(duì)基于16S rRNA基因、用于檢測(cè)F. prausnitzii的引物(FPR-1-FPR-2、FPR-2F-Fprau645R和Fprau223F-Fprau420R)的特異性,選取特異性最好的1對(duì)用于后續(xù)定量和組成的研究。用Clustal X比對(duì)每個(gè)引物與F. prausnitzii和其他細(xì)菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project(RDP)數(shù)據(jù)庫(kù)中使用Probe Match工具比較每個(gè)引物匹配的Faecalibacterium spp.序列數(shù)目。利用本課題組建立的中國(guó)人糞便菌群的16S rRNA基因全長(zhǎng)文庫(kù)的7255個(gè)克隆序列,用Simulated PCR(SPCR)預(yù)測(cè)每對(duì)引物檢測(cè)到的F. prausnitzii和其他細(xì)菌的克隆數(shù);用3對(duì)引物分別對(duì)代表克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示:引物Fprau645R的3’端最后一個(gè)堿基與非F. prausnitzii序列的錯(cuò)配度高于其它引物,它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列數(shù)占其匹配的細(xì)菌序列數(shù)的百分比(97.6%)顯著高于其他引物。SPCR預(yù)測(cè),3對(duì)引物檢測(cè)到的F. prausnitzii克隆數(shù)均為1171左右;在檢測(cè)到的非Faecalibacterium spp.克隆中,FPR-2F-Fprau645R主要是Subdoligranulum spp.,而FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R還有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真實(shí)PCR與SPCR的結(jié)果吻合。結(jié)果表明3對(duì)引物能檢測(cè)到F. prausnitzii和Subdoligranulum spp.,FPR-2F-Fprau645R的特異性優(yōu)于FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R。 接著,運(yùn)用FPR-2F-Fprau645R這對(duì)引物,我們摸索了F. prausnitzii特異性的實(shí)時(shí)定量PCR方法,并建立了F. prausnitzii特異性的變性梯度凝膠電泳(DGGE)的分析方法,并用這兩種方法調(diào)查了56個(gè)單純性肥胖和57個(gè)正常體重成人(年齡、性別、居住地一一匹配,其中女性63人,男性50人)糞便中F. prausnitzii的數(shù)量和組成。 F. prausnitzii特異性實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,女性腸道中F. prausnitzii的數(shù)量顯著高于男性(P=0.005),其中在正常體重組,得到的結(jié)果同上,而在肥胖組并沒有得到上述性別間的差異,提示F. prausnitzii在不同性別間存在數(shù)量差異。糞便F. prausnitzii的數(shù)量與體質(zhì)指數(shù)(BMI)相關(guān)(R=0.214,P=0.023),提示F. prausnitzii與肥胖可能存在一定的關(guān)系。相比于正常體重志愿者,肥胖志愿者腸道中F. prausnitzii的數(shù)量較多,但是差異并不顯著(P=0.101)。 F. prausnitzii類群特異性的PCR-DGGE方法對(duì)14個(gè)肥胖個(gè)體和13個(gè)正常體重對(duì)照個(gè)體進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)兩組人群的F. prausnitzii的組成沒有明顯的差異。 綜上所述,FPR-2F-Fprau645R是檢測(cè)糞便F. prausnitzii的特異性較好的引物。人糞便F. prausnitzii的數(shù)量具有性別差異,并與肥胖具有一定的關(guān)系。本研究利用新建立的F. prausnitzii特異性的PCR-DGGE方法,發(fā)現(xiàn)F. prausnitzii的組成在肥胖和正常體重人群間沒有明顯差異。
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【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2452993