【摘要】：目的 慢性高糖會(huì)對(duì)機(jī)體的組織和器官造成損害，，包括胰島β細(xì)胞。近年來“糖毒性學(xué)說”收到廣泛關(guān)注，認(rèn)為：長期暴露在高濃度的葡萄糖條件下胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能下降，胰島β細(xì)胞減少，且呈不可逆性改變。研究表明其機(jī)制是高糖誘導(dǎo)胰島細(xì)胞胞內(nèi)氧化應(yīng)激而造成胰島β細(xì)胞氧化損傷。PEDF是一種內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激分子。近年來國內(nèi)外多項(xiàng)研究顯其與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病如：代謝綜合癥，腹型肥胖，糖尿病腎病等關(guān)系密切，一些基礎(chǔ)研究也表明PEDF可在多種細(xì)胞中通過不同途徑發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激性能，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。然而在胰島細(xì)胞中的研究未見報(bào)道，本研究旨在明確、探討：1）不同糖濃度孵育，對(duì)INS-1E細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生、細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡率及糖刺激的胰島素分泌功能的影響；2）PEDF是否能夠改善高糖誘導(dǎo)的INS-1E細(xì)胞氧化損傷。 材料與方法 1）INS-1E細(xì)胞種盤次日，以無糖PRMI1640培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞2h，按葡萄糖濃度分為5.6mmol/l組（對(duì)照組），16.7mmol/l組，30mmol/l組，并以甘露醇（mannitol）調(diào)節(jié)滲透壓，即5.6mmol/l glucose+24.4mmol/l mannitol、16.7mmol/lglucose+13.3mmol/l mannitol、30mmol/l glucose，分別用5.6G、16.7G、30G表示。三個(gè)梯度糖濃度培養(yǎng)基處理細(xì)胞48h后，DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量；MTT法檢測細(xì)胞活性；PI/Hoechst法檢測細(xì)胞凋亡率；GSIS（去培養(yǎng)基→清洗細(xì)胞→2.5mmol/l glucose的KRBH平衡30min→清洗→16.7mmol/l glucose的KRBH刺激30min）處理、收集上清，ELISA檢測葡萄糖刺激的胰島素分泌。比較不同濃度高糖處理對(duì)以上指標(biāo)的影響。 2）RT-PCR檢測大鼠腎、胰島、腺泡及INS-1E細(xì)胞內(nèi)PEDF mRNA水平。 3）構(gòu)建PEDF質(zhì)粒，在INS-1E細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PEDF質(zhì)粒并檢測其蛋白表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染是否成功。 4）細(xì)胞種盤次日轉(zhuǎn)染，分組為：5.6G、16.7G、30G三組，同一糖濃度根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為GS(glucose+scramble)，GP（glucose+PEDF）兩組，即5.6GS，5.6GP，16.7GS，16.7GP，30GS，30GP六組。轉(zhuǎn)染后24h（PEDF蛋白表達(dá)高峰）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2h饑餓處理，其后分別用三種糖濃度培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48h，同上方法檢測，比較同一糖濃度組內(nèi)，GP與GS組細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞活性、凋亡率及GSIS差異。（scramble以空質(zhì)粒載體替代） 結(jié)果 1）高糖（16.7G、30G）培養(yǎng)基處理48h后INS-1E細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞凋亡率顯著增加，細(xì)胞活性、胰島素分泌功能顯著降低，并呈濃度依賴性。 2）在大鼠腎、胰島、腺泡及INS-1E細(xì)胞內(nèi)，PEDF的mRNA水平差異顯著，其中INS-1E細(xì)胞內(nèi)其mRNA微乎其微。 3）以2ug PEDF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染INS-1E細(xì)胞，其24、48、72h蛋白過表達(dá)均較顯著，過表達(dá)有效。 4）較之16.7GS、30GS組，對(duì)應(yīng)的16.7GP、30GP組細(xì)胞內(nèi)ROS含量、細(xì)胞凋亡率顯著降低，細(xì)胞活性、 GSIS顯著改善，均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.6mM糖濃度組，PEDF轉(zhuǎn)染對(duì)上述指標(biāo)無顯著影響。 結(jié)論 本研究初步揭示了高糖可致INS-1E細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，并伴隨著細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞活性及胰島素分泌功能逐漸降低，并具有濃度依賴性特征；高糖狀態(tài)下（16.7G、30G），過表達(dá)PEDF可顯著降低INS-1E細(xì)胞內(nèi)ROS的生成及細(xì)胞凋亡率，增加細(xì)胞活性及其胰島素分泌功能，PEDF可改善高糖狀態(tài)下細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 毛剛;2型糖尿病患者血清色素上皮衍生因子水平與尿白蛋白排泄率的相關(guān)性研究[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2010年

2 孫叢;2型糖尿病腎病患者血清PEDF表達(dá)及纈沙坦聯(lián)合阿魏酸鈉干預(yù)研究[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2012年

本文編號(hào)：2452488