【摘要】：目的：本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)Wistar大鼠肺成纖維細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法測定細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）在肺成纖維細(xì)胞上的表達(dá)部位、RT-PCR方法測定ICAM-1mRNA表達(dá)水平，觀察不同濃度IL-1β在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺成纖維細(xì)胞表達(dá)ICAM-1mRNA的影響。 方法：采用組織切塊法對(duì)大鼠胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)：將Wister臨產(chǎn)孕鼠行乙醚吸入麻醉后，立即取出Wister胎鼠，將胎鼠肺組織剪成1mm×1mm×1mm大小的小塊，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，一周左右待細(xì)胞鋪滿瓶底后傳代，用第5~6代形態(tài)、結(jié)構(gòu)一致貼壁生長的肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)分為三大組：(1)對(duì)照組：只應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞6h。(2)不同濃度的IL-1β組：①應(yīng)用含IL-1β（0.5ng/ml）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞；②應(yīng)用含IL-1β（5ng/ml）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞；③應(yīng)用含IL-1β（15ng/ml）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞。以上各組均培養(yǎng)6h。(3)同一濃度IL-1β不同時(shí)間組：應(yīng)用同樣濃度IL-1β（15ng/ml）對(duì)肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間（0h、2h、4h、6h、12h、24h）的培養(yǎng)，分為對(duì)照組、2h組、4h組、6h組、12h組、24h組。 用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察ICAM-1在肺成纖維細(xì)胞上的表達(dá)部位，采用RT-PCR法測定肺成纖維細(xì)胞中ICAM-1mRNA表達(dá)水平。以上各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。 結(jié)果： 1成功培養(yǎng)Wistar胎鼠原代肺成纖維細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用組織切塊法培養(yǎng)Wistar胎鼠肺成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)5~10h后倒置顯微鏡下即觀察到圓形的細(xì)胞從組織塊周圍游走出來，經(jīng)1周左右，這種圓形細(xì)胞逐漸變成橢圓、菱形，并成放射狀，足變長，相鄰細(xì)胞融合，互相連接，細(xì)胞核大而圓，明亮。經(jīng)2~3次胰酶消化純化后，遺留的組織塊、紅細(xì)胞、上皮細(xì)胞等逐漸被清除，剩下形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生長狀態(tài)一致的肺成纖維細(xì)胞（細(xì)胞形態(tài)一致，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核仁清晰，可見核分裂相，生長狀況良好），為理想的肺成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2ICAM-1在肺成纖維細(xì)胞的表達(dá)部位 正常肺成纖維細(xì)胞ICAM-1表達(dá)呈弱陽性，以胞膜為主，包漿偶有表達(dá)，胞核無表達(dá)；ICAM-1在肺成纖維細(xì)胞膜被染成棕黃色顆粒。IL-1β（15ng/mL）干預(yù)后，其胞膜的陽性顆粒顏色明顯變深、增多。 3RT-PCR方法測定肺成纖維細(xì)胞ICAM-1mRNA表達(dá)水平的變化 各實(shí)驗(yàn)組在234bp處均出現(xiàn)了特異性的ICAM-1mRNA條帶，576bp處出現(xiàn)了內(nèi)參Rat β-actin的特異片段。ICAM-1mRNA電泳條帶的光密度掃描顯示，，對(duì)照組ICAM-1mRNA有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，但表達(dá)量甚低（0.112±0.02）。在培養(yǎng)液中加入不同濃度IL-1β（0.5ng/mL、5ng/mL、15ng/mL）培養(yǎng)6h后，ICAM-1mRNA的表達(dá)量分別為0.368±0.02、0.736±0.03、0.805±0.02，與對(duì)照組相比均明顯升高（P0.01），并且ICAM-1mRNA的表達(dá)水平隨著IL-1β濃度的增加而逐漸升高，IL-1β不同濃度組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 同一濃度IL-1β（15ng/mL）刺激下，對(duì)照組、2h組、4h組、6h組、12h組、24h組ICAM-1mRNA的表達(dá)水平分別為0.137±0.013、0.466±0.01、0.672±0.09、0.872±0.03、0.678±0.021、0.502±0.07，結(jié)果顯示盡管IL-1β的濃度相同但是刺激時(shí)間不同時(shí)，ICAM-1mRNA表達(dá)水平并不相同，表現(xiàn)為刺激2h后出現(xiàn)升高（P0.01），6h達(dá)高峰（P0.01），8h逐漸下降趨勢，隨著時(shí)間的推移，未再出現(xiàn)進(jìn)一步升高，在24h仍高于對(duì)照組。各組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 結(jié)論: 1本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織切塊培養(yǎng)法，成功獲得了肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，此方法操作簡單，成功率高，避免了胰酶消化法的過度消化，是目前獲取體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞的較好方法之一。 2ICAM-1在正常的肺成纖維細(xì)胞表達(dá)量甚低，ICAM-1主要表達(dá)于肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞膜。 3IL-1β從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)肺成纖維細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)。 4IL-1β以濃度和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞ICAM-1mRNA的表達(dá)增高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2448114