發(fā)布時(shí)間：2019-03-26 08:58

【摘要】：某些重大疾病的研究需要在體內(nèi)探究免疫系統(tǒng)對(duì)病原體感染、轉(zhuǎn)化以及破壞過(guò)的局部組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過(guò)程,而直接對(duì)疾病個(gè)體進(jìn)行深入研究卻存在一定風(fēng)險(xiǎn),MHC分子限制性的嵌合體小鼠將是一個(gè)最實(shí)用的模型。目前認(rèn)為造血干細(xì)胞能在免疫缺陷或是致死照射的小鼠體內(nèi)發(fā)育分化成免疫系統(tǒng),常見(jiàn)的受體鼠有NOD-scid Il2r γ-/-(NSG)小鼠及BALB/c背景的Rag2-/-Il2r γ-/-小鼠。同樣,外源肝細(xì)胞或是胚胎干細(xì)胞也可以在某些特殊的受體小鼠體內(nèi)擴(kuò)增成為肝臟嵌合小鼠,比如尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑轉(zhuǎn)基因小鼠模型(uPA模型)及延胡索酰乙酰乙酸脫氫酶缺陷小鼠模型(FAH模型)。然而,上述兩種模型都不是研究免疫系統(tǒng)與病原體感染組織相互作用的最佳模型。 人體生物學(xué)的研究受限于倫理因素及技術(shù)難度,人源化小鼠的發(fā)展卻為其提供了便利。免疫系統(tǒng)人源化(HIS)小鼠在研究人類免疫反應(yīng)及嗜人免疫系統(tǒng)病原菌感染方面表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景；而肝臟人源化小鼠也在人類嗜肝病原菌感染研究和抗肝炎病毒藥物的臨床評(píng)判方面發(fā)揮了重要的作用。但是,進(jìn)一步研究某些特殊疾病(如HBV,HCV感染引發(fā)的肝炎以及瘧疾的肝臟階段)的病理發(fā)生,免疫關(guān)系,以及發(fā)病機(jī)制需要一種更好的小鼠模型,即免疫系統(tǒng)和病原體靶向組織同時(shí)實(shí)現(xiàn)人源化,并能通過(guò)MHC分子相互識(shí)別。最近,研究者們建立了AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型,他們從15-18周的胎肝組織中分離得到肝臟祖細(xì)胞,并跟CD34+人造血干細(xì)胞一起轉(zhuǎn)輸給BALB/c背景的Rag2-/-Il2r γ-/-小鼠,從而成功建立了免疫系統(tǒng)和肝臟同時(shí)人源化的小鼠模型。盡管該模型能較好滿足研究的需要,但是胎肝組織的獲取難度限制了該模型的廣泛應(yīng)用。 近年來(lái),也有報(bào)道稱通過(guò)骨髓轉(zhuǎn)輸?shù)姆椒?造血干細(xì)胞能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成肝細(xì)胞。在本論文中,我們用延胡索酰乙酰乙酸脫氫酶缺陷的小鼠進(jìn)行骨髓重建,以探求造血干細(xì)胞能否在受體小鼠體內(nèi)同時(shí)發(fā)育成免疫系統(tǒng)和肝臟細(xì)胞。該模型的成功建立將極大地促進(jìn)疾病狀態(tài)下免疫系統(tǒng)與肝細(xì)胞的相互作用的研究。 本研究中,我們首先通過(guò)體重監(jiān)測(cè),血清ALT檢測(cè),以及肝損傷的觀測(cè)等手段觀察了FAH缺陷鼠在NTBC停藥后的生長(zhǎng)情況；接著,我們將小鼠肝細(xì)胞或人源肝細(xì)胞系轉(zhuǎn)入FAH缺陷鼠體內(nèi),觀察外源肝細(xì)胞能否成功植入受體鼠肝臟并實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增；然后,我們嘗試運(yùn)用同基因,異基因,甚至異種骨髓移植的方法在FAH缺陷鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建。在轉(zhuǎn)輸骨髓后,給受體鼠停止NTBC用藥,并觀察其體重及血清ALT變化。為評(píng)判免疫系統(tǒng)的重建,我們每?jī)芍軝z測(cè)一次外周血。重建8周后,我們分離檢測(cè)嵌合鼠的骨髓,胸腺,外周血,肝臟以及淋巴結(jié)中供體淋巴細(xì)胞分布情況,并用組織學(xué)染色的方法分析小鼠脾臟和淋巴結(jié)中的免疫重建狀況。與此同時(shí),我們給嵌合鼠免疫HBV疫苗或是OVA蛋白,然后用RIA或ELISA的方法檢測(cè)小鼠血清中特異抗體的產(chǎn)生情況。為評(píng)價(jià)肝細(xì)胞的重建,我們分離停藥后長(zhǎng)期存活鼠的肝細(xì)胞并用流式分析表型。同時(shí),我們也用HE染色及免疫組化來(lái)分析肝組織切片。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn),我們?nèi)〉昧艘韵乱恍┲饕Y(jié)果： 1.FAH小鼠在NTBC停藥后自發(fā)肝損傷 首先,我們對(duì)比了FAH缺陷鼠在NTBC停藥與不停藥時(shí)的生長(zhǎng)情況。我們發(fā)現(xiàn),停藥后缺陷鼠的體重逐漸下降,當(dāng)體重?fù)p失達(dá)到30%時(shí),小鼠就會(huì)死亡。血清ALT也在逐周增加提示肝損傷在逐漸加重。分離停藥鼠的肝細(xì)胞體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)停藥后肝細(xì)胞更易凋亡。肝臟組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到肝臟局部,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),T,B淋巴細(xì)胞都可能參與了停藥后小鼠肝損傷的過(guò)程。總之,上述結(jié)果表明,NTBC能夠保護(hù)FAH缺陷鼠免于肝損傷,NTBC的撤除可作為啟動(dòng)FAH缺陷鼠肝細(xì)胞壞死的開(kāi)關(guān)。 2.外源肝細(xì)胞向FAH移植后的體內(nèi)擴(kuò)增 接著,我們將新鮮分離的EGFP-Tg鼠的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)入FAH缺陷鼠體內(nèi),然后給小鼠停藥。與不轉(zhuǎn)輸?shù)耐Ｋ帉?duì)照組相比,轉(zhuǎn)輸組小鼠的體重及血清ALT水平能較快的恢復(fù)到正常水平,并且轉(zhuǎn)輸組小鼠的存活時(shí)間大大延長(zhǎng)。同時(shí),我們?cè)谵D(zhuǎn)輸鼠的肝臟內(nèi)檢測(cè)到EGFP陽(yáng)性的供體肝細(xì)胞,它們能提供FAH來(lái)恢復(fù)受體鼠的肝臟功能。但是,當(dāng)我們用人源肝細(xì)胞系L02細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)輸時(shí),受體小鼠會(huì)發(fā)生肝臟腫瘤而死亡。我們?cè)谛∈蟮母闻K中觀察到許多腫瘤結(jié)節(jié),可能是L02細(xì)胞系在體內(nèi)擴(kuò)增太快導(dǎo)致的。 3.同基因骨髓移植后FAH小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建 接下來(lái),我們將同基因型的骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)入到FAH小鼠體內(nèi)觀察重建情況。我們選取了兩種供體小鼠,分別是EGFP-Tg小鼠和HBs-Tg小鼠。我們?cè)谵D(zhuǎn)輸28天后給小鼠停藥,結(jié)果發(fā)現(xiàn),絕大部分骨髓轉(zhuǎn)輸小鼠在停藥后能存活至少5個(gè)月以上。骨髓轉(zhuǎn)輸小鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的造血重建能力,髓系及淋巴系的造血發(fā)育都和正常供體鼠一樣。嵌合鼠外周血中NK,B,CD4T,CD8T細(xì)胞的數(shù)量也能逐漸發(fā)育正常,8周后受體鼠各臟器中免疫細(xì)胞就能重建完全,脾臟及淋巴結(jié)的組織學(xué)染色也進(jìn)一步證明免疫重建的成功。為檢測(cè)重建免疫系統(tǒng)的功能,我們用HBV疫苗免疫小鼠2次,結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有嵌合鼠都能產(chǎn)生跟供體鼠相類似的HBV特異性的抗體。我們用停藥后長(zhǎng)期存活的嵌合小鼠來(lái)評(píng)判肝細(xì)胞重建狀況。肝組織染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)供體來(lái)源的肝細(xì)胞成簇存在,進(jìn)一步用流式分析肝細(xì)胞的表型發(fā)現(xiàn)髓樣單個(gè)核細(xì)胞(CD45+F4/80+Gr-1+CD11b+CD11c-)可能是體內(nèi)骨髓來(lái)源肝細(xì)胞的前體。綜上結(jié)果可知,同基因型小鼠來(lái)源的造血干細(xì)胞是能夠在FAH缺陷鼠體內(nèi)同時(shí)重建免疫系統(tǒng)及肝臟系統(tǒng)的。 4.異基因骨髓移植后FAH小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建 確定同基因型的骨髓能在FAH缺陷鼠體內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝細(xì)胞的雙重建之后,我們又進(jìn)行了異基因型的骨髓移植。我們同樣選取了兩種供體小鼠,分別是C3H/HeJ小鼠(H-2k)and HBV-Tg小鼠(H-2d)。大約60%的異基因骨髓移植小鼠能在停藥后存活5個(gè)月以上。通過(guò)檢測(cè)嵌合鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例,我們發(fā)現(xiàn)NK,B,CD4T,CD8T淋巴細(xì)胞能逐漸發(fā)育正常,脾臟及淋巴結(jié)的組織學(xué)染色也進(jìn)一步證明免疫系統(tǒng)重建成功。跟供體鼠相似,嵌合鼠在OVA蛋白免疫后能產(chǎn)生OVA特異性的抗體。同時(shí),從嵌合鼠中分離出的肝細(xì)胞部分表達(dá)供體鼠MHC-I類分子,并且這種肝細(xì)胞也表達(dá)受體鼠的MHC-I分子及CD45抗原,提示骨髓來(lái)源的肝細(xì)胞可能與受體原有的肝細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞融合。 5.異種骨髓移植后FAH小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建 接下來(lái),我們想探明異種骨髓細(xì)胞能否在FAH缺陷鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建。我們將S.D.大鼠(RT1A,Fah+/+)的骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)入FAH缺陷鼠體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)約有50%的嵌合鼠停藥后能存活5個(gè)月以上,血清轉(zhuǎn)氨酶也維持在正常水平。嵌合小鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的造血重建能力,髓系及淋巴系的造血發(fā)育也很正常,外周血中供體來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞(RT1A+)比例接近100%。嵌合鼠外周血中NK,B,CD4T,CD8T淋巴細(xì)胞逐漸發(fā)育正常,8周后受體鼠各臟器中T細(xì)胞比例接近于供體大鼠。與此同時(shí),從嵌合鼠中分離出的肝細(xì)胞部分表達(dá)大鼠RT1A分子,肝臟組織學(xué)分析也顯示FAH陽(yáng)性肝細(xì)胞成團(tuán)分布�？傊�,異種來(lái)源的造血干細(xì)胞同樣能在FAH缺陷鼠體內(nèi)完成雙重建。 6.人源造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)輸后FAH-rag2雙缺陷小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)及肝臟的雙重建 基于之前同基因,異基因,異種骨髓轉(zhuǎn)輸所取得的結(jié)果,我們將純化的人臍血干細(xì)胞轉(zhuǎn)入FAH-rag2雙缺陷小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),停藥后轉(zhuǎn)輸鼠體重先是由于亞致死照射下降10%左右,然后迅速恢復(fù)正常并穩(wěn)步上升。血清ALT也一直維持在較低水平,暗示著人源造血干細(xì)胞的移植部分恢復(fù)了嵌合鼠體內(nèi)的肝臟功能。同時(shí)我們注意到,與非轉(zhuǎn)輸對(duì)照鼠相比,大多數(shù)嵌合鼠的存活時(shí)間更長(zhǎng)。另外,嵌合鼠的肝臟功能恢復(fù)與人造血干細(xì)胞的植入程度有關(guān),比較不同的受體小鼠,我們發(fā)現(xiàn)FRG受體鼠在接受轉(zhuǎn)輸后存活時(shí)間長(zhǎng)于FAH單缺陷鼠。我們也確實(shí)在FRG受體鼠體內(nèi)檢測(cè)到更多的人源細(xì)胞。肝臟HE染色能檢測(cè)到人源肝細(xì)胞,它的細(xì)胞更大,嗜酸性染色較淺。由于B6背景的小鼠HSC植入較少,我們?cè)诟谓M織中只檢測(cè)到少量FAH陽(yáng)性的人源肝細(xì)胞�？傊�,人源HSC轉(zhuǎn)輸后,受體鼠肝臟內(nèi)確實(shí)有部分肝細(xì)胞被人源肝細(xì)胞取代,它們產(chǎn)生FAH來(lái)減輕肝損傷。 小結(jié)：本研究主要發(fā)現(xiàn)來(lái)自一個(gè)個(gè)體的造血干細(xì)胞能在免疫缺陷或是照射過(guò)的FAH缺陷鼠體內(nèi)成功發(fā)育分化成免疫細(xì)胞和肝細(xì)胞。我們第一次比較系統(tǒng)地逐步通過(guò)同基因,異基因,異種骨髓移植,證明了單種造血干細(xì)胞可以在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫系統(tǒng)及肝細(xì)胞的雙重建。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)給FAH-rag2雙缺陷小鼠轉(zhuǎn)輸人源造血干細(xì)胞能部分恢復(fù)受體小鼠的肝臟功能。上述結(jié)果提示,將來(lái)運(yùn)用更加適合人源化構(gòu)建的免疫缺陷型FAH小鼠,如Fah-/-NSG小鼠,有可能構(gòu)建出一種更理想的人源化小鼠,這種小鼠具備免疫系統(tǒng)及肝細(xì)胞的雙重人源化,并具備HLA分子識(shí)別的一致性。盡管我們的模型還有許多有待改進(jìn)的地方,但我們相信這種雙重建小鼠模型將給臨床前檢測(cè)及免疫系統(tǒng)與病變器官的相互作用研究提供更好的機(jī)會(huì)!
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R-332;R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2447384