發(fā)布時(shí)間：2019-03-22 07:30

【摘要】：基因傳遞系統(tǒng)是基因治療中的重要組成部分，缺少安全有效的基因載體是阻礙基因治療臨床試驗(yàn)成功的主要因素。在非病毒基因載體中聚乙烯亞胺（PEI）因具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”是研究的最為廣泛的陽離子聚合物基因載體。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PEI的基因轉(zhuǎn)染效率和毒性與其分子量密切相關(guān)。高分子量的PEI如PEI（25kDa）因具有較高的正電荷密度而具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)過高的電荷密度和分子本身的不可降解性也導(dǎo)致其細(xì)胞毒性比較大，體內(nèi)應(yīng)用受到限制。低分子量PEI（2kDa）毒性很小卻基本沒有基因轉(zhuǎn)染效率。因此如何利用無毒的低分子量PEI設(shè)計(jì)出低毒高效的基因載體在近年來受到廣泛關(guān)注。很多學(xué)者通過PEI分子的PEG化修飾來實(shí)現(xiàn)降低載體細(xì)胞毒性和增強(qiáng)載體血清相容性的目的。 與傳統(tǒng)的將PEG分子接到聚合物或納米粒子外圍的修飾手段不同，，在本論文第二章中我們將PEG分子作為主鏈，接枝小分子PEI合成基因載體。實(shí)驗(yàn)中首先通過麥克爾加成反應(yīng)，將聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，258Da）與二硫蘇糖醇（DTT）反應(yīng)，得到含有可降解酯鍵的線性聚合物PEG-DTT，然后以羰基二咪唑（CDI）作為接頭將PEI（800Da）連接到聚合物PEG-DTT上。通過控制PEGDA和DTT的比例（從1.2：1到1：1.2）得到五種不同分子量和結(jié)構(gòu)的基因載體(PEG-DTT)-g-PEIs；通過凝膠滲透色譜（GPC）、氫核磁共振譜（1H-HMR）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對(duì)載體的分子量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征；研究了載體的毒性及其與DNA形成的復(fù)合物粒徑和電位；并對(duì)該基因載體的體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(PEG-DTT)-g-PEIs/DNA復(fù)合物的粒徑小于200nm，電位在+20-40mV；載體(PEG-DTT)-g-PEIs與PEI（25kDa）相比具有較低的細(xì)胞毒性；對(duì)HeLa、HepG2、MCF-7和COS-7四種腫瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率都高于PEI（25kDa），并且轉(zhuǎn)染效率不受高濃度血清（30%）的抑制；荷瘤裸鼠的瘤內(nèi)基因轉(zhuǎn)染結(jié)果說明該載體對(duì)HepG2腫瘤的轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于PEI（25kDa）。這些結(jié)果表明(PEG-DTT)-g-PEIs系列基因載體具有很好的應(yīng)用前景。 為了得到具有更高轉(zhuǎn)染效率的腫瘤靶向基因載體，在第三章中我們嘗試通過核酸適配體篩選技術(shù)獲得腫瘤細(xì)胞特異性的核酸適配體。 因短肽類化合物具有易合成、低成本且能大量制備、易與各類生物活性分子結(jié)合、降解可控等優(yōu)點(diǎn)，短肽類水凝膠具有很好的生物學(xué)應(yīng)用前景。其中，因其含水量高、能夠形成類似于細(xì)胞外基質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)而被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程。在細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程用水凝膠中，存在著從膠體中分離培養(yǎng)細(xì)胞困難的問題。因此設(shè)計(jì)能夠在外界刺激下實(shí)現(xiàn)從凝膠到溶液的轉(zhuǎn)變的響應(yīng)型水凝膠對(duì)于在水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞的分離及后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究具有重要意義。 在第四章中我們合成了幾種含有金剛烷分子的多肽Ada-GFFYKn-ss-K(4-n)-CONH_2，能夠被還原劑谷胱甘肽（GSH）或二硫蘇糖醇（DTT）還原而形成水凝膠，且形成的水凝膠能夠?qū)Ζ?環(huán)糊精或其衍生物產(chǎn)生凝膠-溶液的響應(yīng)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH3T3）在膠上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并能夠利用膠體對(duì)甲基-β-環(huán)糊精的響應(yīng)特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)NIH3T3細(xì)胞的快速分離，且這種分離方式對(duì)細(xì)胞活力無不利影響。這些研究結(jié)果說明這種響應(yīng)型金剛烷-多肽水凝膠在水凝膠中培養(yǎng)細(xì)胞的進(jìn)一步分析研究方面具有很大的應(yīng)用潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R3416;TB383.1

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本文編號(hào)：2445389