【摘要】：嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染,失血性、內(nèi)毒素等各型休克晚期均存在血管低反應(yīng)性,即血管對(duì)各種血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性減弱甚至不反應(yīng)。這種血管的低反應(yīng)性嚴(yán)重影響著休克的發(fā)展及治療,是影響休克患者死亡率的重要原因。 目前認(rèn)為休克后的血管低反應(yīng)性發(fā)生主要是由于腎上腺素能、內(nèi)皮素受體等失敏(表達(dá)下降和或親和力下降);鉀、鈣通道的過(guò)度激活引起血管平滑肌細(xì)胞膜的超極化,以及血管平滑肌細(xì)胞鈣失敏所致。 內(nèi)毒素休克的主要特征是機(jī)體的過(guò)度炎癥反應(yīng),大量細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、ΙL?6等釋放,在內(nèi)毒素休克的病理生理過(guò)程中起重要作用。體內(nèi)、外研究均顯示IL-1β能夠介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)性下降,目前認(rèn)為它主要通過(guò)ΝΟ依賴(lài)性和ΝΟ非依賴(lài)性機(jī)制來(lái)介導(dǎo)的,前者認(rèn)為IL-1β是通過(guò)使iNOS活性升高而使ΝΟ產(chǎn)量增多而發(fā)揮作用的;后者認(rèn)為IL-1β是通過(guò)使血管受體如抗利尿激素受體、內(nèi)皮素受體等表達(dá)量下降和或親和力下降及激活KATP通道、BKCa通道引起血管平滑肌細(xì)胞膜超極化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但是針對(duì)上述機(jī)制糾正這些不利因素,尚不能完全恢復(fù)血管反應(yīng)性,更不能完全緩解內(nèi)毒素休克的病理生理進(jìn)程,提示還存在著其它機(jī)制。與出血性休克一致,本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素休克后期同樣存在鈣失敏,且鈣失敏在休克后血管低反應(yīng)發(fā)生中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素休克后IL-1β可使血管平滑肌細(xì)胞α_1腎上腺素受體基因表達(dá)下調(diào),IL-1β是否通過(guò)α_1腎上腺素能受體失敏和鈣失敏來(lái)介導(dǎo)休克后的血管低反應(yīng)性發(fā)生呢?目前尚不清楚。為此,本實(shí)驗(yàn)利用家兔內(nèi)毒素休克模型和離體血管環(huán)對(duì)此進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。 主要實(shí)驗(yàn)方法: 第一部分:明確IL-1β是否通過(guò)調(diào)節(jié)家兔血管α_1腎上腺素能受體敏感性和鈣敏感性來(lái)介導(dǎo)內(nèi)毒素休克后血管反應(yīng)性的變化 1.采用LPS靜注復(fù)制家兔內(nèi)毒素休克模型,測(cè)定不同時(shí)相點(diǎn)(正常,給LPS后30 min、1h、2h、4h)腸系膜上動(dòng)脈血管反應(yīng)性,鈣敏感性,α_1AR mRNA表達(dá)及血清IL-1β的水平,觀(guān)察其變化規(guī)律,分析它們之間的相關(guān)性。 2.在無(wú)菌無(wú)RNA酶的實(shí)驗(yàn)條件下,取正常家兔內(nèi)皮完整的SMA,將其與不同濃度(25、50、100、150、200 ng/ml)IL-1β孵育12h,觀(guān)察其血管反應(yīng)性和鈣敏感性以及α_1(包括α_(1A)、α_(1B)、α_(1D)三個(gè)亞型)腎上腺素能受體(α_1AR)的mRNA水平的變化(用RT-PCR法)。 3.應(yīng)用4μg/kg IL-1ra(IL-1受體拮抗劑,peprotech)在家兔給LPS后30 min靜脈注射,觀(guān)察給LPS后4h家兔SMA的血管反應(yīng)性和鈣敏感性以及α_1AR mRNA水平的變化。 第二部分:初步探索IL-1β調(diào)節(jié)血管鈣敏感性的機(jī)制 1.應(yīng)用PKC、Rho激酶特異的激動(dòng)劑和拮抗劑,分別為:PKC (10~(-5)mol/L PMA和10~(-5)mol/L staurosporine)及Rho kinase (10~(-9)mol/L Ang-Ⅱ和10~(-5)mol/L Y27632),在加入梯度濃度Ca~(2+)前孵育血管環(huán)15min,觀(guān)察其對(duì)經(jīng)200ng/ml IL-1β孵育SMA的鈣敏感性的影響。 2.應(yīng)用非放射性酶活性測(cè)定試劑盒(Promega和Cyclex MBL),測(cè)定與不同濃度(0,50,100ng/ml)IL-1β孵育的SMA的PKC、Rho激酶活性變化。 3.應(yīng)用Western blot方法,測(cè)定與不同濃度(0,50,100ng/ml)IL-1β孵育的SMA MLC_(20)磷酸化水平的變化。 第三部分:初步探索IL-1β介導(dǎo)α_1腎上腺素能受體失敏的機(jī)制 1.應(yīng)用10μmol/L磷脂酶C(PLC)特異性抑制劑u73122,并設(shè)立空白對(duì)照組(不加任何試劑)和u73343組(加入u73122的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物u73343,但無(wú)其類(lèi)似功能),觀(guān)察其對(duì)經(jīng)不同濃度IL-1β孵育的SMAα_1AR對(duì)PE反應(yīng)性的影響。 2.應(yīng)用PC-PLC活性測(cè)定試劑盒(invitrogen) ,測(cè)定經(jīng)不同濃度(0 , 50 ,100ng/ml)IL-1β孵育的SMA的PLC活性變化。 3.應(yīng)用50μmol/L JAK-STAT3途徑抑制劑AG490,將其與IL-1β共同孵育SMA,觀(guān)察其對(duì)50ng/ml IL-1β孵育的SMAα_1AR mRNA表達(dá)的影響。 主要研究結(jié)果: 一.IL-1β通過(guò)調(diào)節(jié)α_1腎上腺素能受體敏感性和鈣敏感性介導(dǎo)內(nèi)毒素休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生 1.家兔內(nèi)毒素休克后SMA存在鈣失敏和α_1AR失敏,表現(xiàn)為L(zhǎng)PS靜注后,早期(即給LPS后30min~1h)SMA血管環(huán)對(duì)PE和鈣的反應(yīng)性升高,量-效曲線(xiàn)左移,Emax升高(p0.05或p0.01),pD_2值無(wú)明顯變化(p0.05);隨著時(shí)間的延長(zhǎng),SMA血管環(huán)對(duì)PE和鈣的反應(yīng)性迅速下降,到晚期(給LPS 2h和4h后)明顯降低,其量-效曲線(xiàn)明顯右移, Emax明顯降低(p0.01),pD_2值明顯降低(p0.01)。家兔給LPS后30min起,α_1AR(主要是α_1B和α_1DAR)mRNA表達(dá)水平即開(kāi)始明顯下降(p0.05),并呈時(shí)間依賴(lài)性降低。家兔內(nèi)毒素休克后血清IL-1β在給LPS后2h開(kāi)始升高,到4h時(shí)升高明顯(p0.01),血清IL-1β水平與內(nèi)毒素休克晚期血管反應(yīng)性和鈣敏感性及α_1AR mRNA表達(dá)水平的變化存在顯著負(fù)相關(guān)(p0.01),血管反應(yīng)性和鈣敏感性變化存在顯著正相關(guān)(p0.01)。 2.與空白對(duì)照組(不含IL-1β孵育)相比,經(jīng)與不同濃度(25ng/ml-200ng/ml)IL?1β孵育的SMA對(duì)PE的反應(yīng)性均有降低(p0.05或p0.01) ;在與25ng/ml、50ng/ml IL-1β孵育12h后血管環(huán)對(duì)鈣敏感性的量效曲線(xiàn)即開(kāi)始右移,Emax開(kāi)始下降,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在100ng/ml時(shí)Emax明顯下降(p0.05),在150ng/ml和200ng/ml時(shí)下降更明顯(p0.01);α_1AR(包括α_(1A)、α_(1B)、α_(1D)三個(gè)亞型)mRNA從25ng/ml開(kāi)始即有明顯下降(p0.05),呈濃度依賴(lài)性降低。 3.IL-1ra能明顯提高給LPS后4h組SMA血管環(huán)的鈣敏感性和α_1AR的反應(yīng)性(p0.05),Emax值明顯升高(p0.05),但pD_2值無(wú)明顯改變(p0.05)。IL-1ra能明顯提高α_1AR(主要是B、D兩個(gè)亞型)mRNA表達(dá)水平(p0.05)。 二.IL-1β調(diào)節(jié)血管鈣敏感性的初步機(jī)制 1. PKC、Rho激酶的激動(dòng)劑能明顯提高200 ng/ml IL-1β孵育組的血管鈣敏感性,表現(xiàn)為量-效曲線(xiàn)左移,Emax增大(p0.05),Rho激酶特異的抑制劑能明顯降低其鈣敏感性,表現(xiàn)為量?效曲線(xiàn)右移,Emax減小(p0.05),但PKC特異的抑制劑卻不能明顯改變其鈣敏感性(p0.05)。 2.與空白對(duì)照組相比,PKC、Rho激酶的活性在50 ng/ml IL-1β孵育組已經(jīng)開(kāi)始下降,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),而在100 ng/ml IL-1β孵育組明顯下降(p0.05)。 3.與空白對(duì)照組相比,MLC_(20)磷酸化水平在50 ng/ml IL-1β孵育組已經(jīng)開(kāi)始下降,100 ng/ml IL-1β孵育組SMA中明顯下降,表現(xiàn)為MLC_(20)磷酸化/非磷酸化灰度比值明顯下降(p0.05)。 三.IL-1β介導(dǎo)α_1腎上腺素能受體失敏的初步機(jī)制 1.與u73343組及空白對(duì)照組相比,u73122不能改變IL-1β孵育組SMA血管環(huán)α_1AR對(duì)PE的反應(yīng)性,量效曲線(xiàn)、Emax值及pD_2值均無(wú)明顯變化(p0.05)。 2.與空白對(duì)照組相比,50 ng/ml及100 ng/ml IL-1β孵育組SMA中PLC活性無(wú)明顯變化,表現(xiàn)為各組的熒光強(qiáng)度值無(wú)明顯差異(p0.05)。 3.與100ng/ml IL-1β孵育組及100ng/ml IL-1β+DMSO孵育組相比,AG490能明顯升高100 ng/ml IL-1β孵育組α_1AR(主要是α_1B、α_1D兩個(gè)亞型)mRNA表達(dá)水平,提示JAK-STAT3通路可能參與了IL-1β調(diào)節(jié)α_1AR的表達(dá)。 結(jié)論: 1. IL-1β可能通過(guò)調(diào)節(jié)α_1腎上腺素能受體和鈣敏感性參與內(nèi)毒素休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生 2. IL-1β可能通過(guò)改變PKC、Rho激酶的活性及MLC_(20)的磷酸化水平介導(dǎo)內(nèi)毒素休克血管鈣敏感性降低。 3. IL-1β可能通過(guò)JAK-STAT3途徑調(diào)節(jié)α_1腎上腺素能受體的表達(dá)介導(dǎo)α_1腎上腺素能受體失敏。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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2 薛婧;代蓉;董柳慧;淤澤溥;;四逆湯君藥之辨析[J];云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年02期

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本文編號(hào)：2445250