【摘要】：背景 瞬時(shí)感受器電位離子通道香草素受體亞家族4(transient receptor potential vanilloid receptor4, TPRV4)是一種非選擇性通透性陽(yáng)離子通道,具有機(jī)械敏感性,其廣泛分布于動(dòng)物腦、背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)、腎和肺等組織。TRPV4可被多種刺激激活,開(kāi)放時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的明顯升高。TRPV4參與生物體傷害性感受的傳導(dǎo),在DRG神經(jīng)元介導(dǎo)的疼痛傳遞過(guò)程中起重要作用。大鼠TRPV4全長(zhǎng)為871個(gè)氨基酸(amino acid, aa),與其他TRP家族成員相似,TRPV4通道結(jié)構(gòu)包括氨基端(N termini, Nt)、羧基端(C termini, Ct)兩個(gè)胞質(zhì)內(nèi)片段及6個(gè)跨膜區(qū)(TM1-TM6),并在TM5和TM6之間形成一個(gè)袢環(huán)結(jié)構(gòu)。目前認(rèn)為,TRPV4的胞質(zhì)內(nèi)片段是TRPV4與其他蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。 我們的前期研究提示,TRPV4與DRG損傷后的機(jī)械痛敏有關(guān),但持續(xù)受壓后DRG上TRPV4通道表達(dá)升高的機(jī)制尚待研究。對(duì)持續(xù)受壓28天的大鼠DRG進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞骨架有關(guān)的膜聯(lián)蛋白A2的表達(dá)明顯增高,而細(xì)胞骨架微管蛋白β5明顯降低。因此推測(cè)細(xì)胞骨架(微管蛋白β5)及其相關(guān)蛋白(膜聯(lián)蛋白A2)可能通過(guò)某種途徑參與了機(jī)械性疼痛傳導(dǎo)過(guò)程中TRPV4通道表達(dá)的調(diào)控。 膜聯(lián)蛋白(annexins)家族是一類(lèi)Ca2+依賴(lài)性膜磷脂結(jié)合蛋白。膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2)是膜聯(lián)蛋白家族成員,與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜動(dòng)力學(xué)、囊泡運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)。S100A10-膜聯(lián)蛋白A2復(fù)合體可與TRPV5及TRPV6通道結(jié)合,調(diào)節(jié)通道活性。微管蛋白(35(tubulin β5)是微管蛋白的一個(gè)亞型。α/p微管蛋白異二聚體是微管的主要組成部分,微管作為重要的細(xì)胞骨架成分在許多關(guān)鍵性細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。微管與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能有關(guān),微管動(dòng)力學(xué)的改變可以導(dǎo)致神經(jīng)的病理學(xué)改變。微管蛋白二聚體及聚合的微管可以Ca2+依賴(lài)性的結(jié)合于TRPV1,調(diào)節(jié)通道功能。目前有研究表明細(xì)胞骨架及其相關(guān)蛋白,如膜聯(lián)蛋白A2和微管蛋白p與細(xì)胞機(jī)械刺激傳導(dǎo)過(guò)程關(guān)系密切,但其分子機(jī)制尚不明確。 很多既往研究提示TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5存在相互作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建重組真核表達(dá)載體,為下一步研究各蛋白的功能及相互作用提供必要的載體模型。 目的 通過(guò)基因工程學(xué)技術(shù),克隆TRPV4及其N(xiāo)、C末端基因,構(gòu)建標(biāo)簽表達(dá)載體。用TRPV4各段及膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5標(biāo)簽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,行western blot及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)其蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)分布情況。 方法 以美國(guó)Duke大學(xué)W. Liedtke教授贈(zèng)與的TRPV4cDNA全長(zhǎng)質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,采用PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、搖菌、質(zhì)粒提取等步驟,構(gòu)建TRPV4及其N(xiāo)t, Ct帶Myc標(biāo)簽表達(dá)載體。以本課題組制備的膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5的FLAG標(biāo)簽質(zhì)粒為模板,通過(guò)轉(zhuǎn)化、搖菌擴(kuò)增、質(zhì)粒提取等步驟獲得大量質(zhì)粒備用。 TRPV4全長(zhǎng)及胞質(zhì)內(nèi)片段、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,采用western blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 結(jié)果 1. TRPV4cDNA全長(zhǎng)及氨基端、羧基端標(biāo)簽表達(dá)載體的成功構(gòu)建 PCR成功擴(kuò)增TRPV4cDNA全長(zhǎng)及胞質(zhì)內(nèi)氨基端、羧基端基因片段,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在相應(yīng)位置出現(xiàn)DNA條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果與Genebank基因序列完全一致,插入方向和讀碼框架正確,重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。 2. TRPV4全長(zhǎng)及各段載體、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá) TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白樣品,分別在相應(yīng)98kD、39kD、55kD處出現(xiàn)單一蛋白條帶,pcDNA3.1(+)空載體與pcDNA3.1-Myc,His A空載體對(duì)照組和陰性對(duì)照組無(wú)特異條帶出現(xiàn)。 重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)后,細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)到外源基因在HEK293細(xì)胞中有表達(dá)。結(jié)果提示,TRPV4主要位于細(xì)胞膜,胞質(zhì)內(nèi)也有少量分布,膜聯(lián)蛋白A2在細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)都有分布,微管蛋白β5也廣泛分布于胞膜和胞質(zhì)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體組和陰性對(duì)照組的HEK293細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到標(biāo)記的蛋白熒光信號(hào)。 結(jié)論 本部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了TRPV4全長(zhǎng)及氨基端、羧基端胞質(zhì)內(nèi)片段和膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白p5表達(dá)載體,并通過(guò)轉(zhuǎn)染使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。為后續(xù)在體外相對(duì)單純的環(huán)境下觀察TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5在傷害性刺激傳導(dǎo)的作用,及各蛋白間的相互作用研究打下基礎(chǔ),提供必要的載體模型。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 謝浩;郭小明;;融合標(biāo)簽技術(shù)在膜蛋白結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2009年01期

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本文編號(hào)：2441589