【摘要】：肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)屬于革蘭氏陽性病原微生物,可引起鼻竇炎、中耳炎、肺炎、敗血癥、腦膜炎等嚴(yán)重疾病。在過去抗生素是治療肺炎鏈球菌感染的主要手段,但隨著抗生素的大量使用,耐藥菌株在世界范圍內(nèi)廣泛傳播,給臨床治療帶來很大的麻煩。因此,尋找新的抑菌藥物和疫苗成為目前研究的熱點(diǎn)。 目的：分別比較萬古霉素與釕配合物X-03處理前后肺炎鏈球菌D39蛋白表達(dá)譜的差異,對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析,試圖明白萬古霉素和釕配合物X-03抑制肺炎鏈球菌生長(zhǎng)的作用機(jī)制,為研發(fā)新的藥物和疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本研究利用雙向電泳技術(shù)(2-DE)分離處理組和對(duì)照組的總蛋白質(zhì)和膜蛋白,使用ImageMaster圖像分析軟件對(duì)處理組和對(duì)照組的2-DE圖譜進(jìn)行分析比較,找出差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。應(yīng)用MALDI-TOF-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。運(yùn)用Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù),如果Protein ScoreC.I.%大于95%,則認(rèn)為鑒定結(jié)果是可信的。利用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行歸類和分析。最后采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行mRNA水平的驗(yàn)證。 結(jié)果：(1)建立了肺炎鏈球菌膜蛋白2-DE圖譜,結(jié)合2-DE和2D-LC-ESI-MS/MS兩種方法總共鑒定到164個(gè)膜蛋白,約占總共鑒定到的蛋白的60%。通過Gene Ontology (GO)分析顯示這些蛋白主要涉及膜轉(zhuǎn)運(yùn)與結(jié)合、細(xì)胞粘附、氧化、蛋白降解、翻譯、核酸和糖代謝等途徑。(2)比較分析萬古霉素處理組與對(duì)照組的雙向電泳圖譜,發(fā)現(xiàn)58個(gè)差異蛋白,通過質(zhì)譜鑒定了33個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn),其中29個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在處理組表達(dá)上調(diào),4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法從mRNA轉(zhuǎn)錄水平對(duì)其中的4個(gè)蛋白質(zhì)(GalU、HprK、RecA、SpxB)進(jìn)行分析,結(jié)果表明其mRNA表達(dá)水平均與蛋白表達(dá)水平相一致。(3)利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析釕配合物X-03處理組與對(duì)照組的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜,通過質(zhì)譜鑒定了66個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn),其中有32個(gè)蛋白在處理組表達(dá)下調(diào)和34個(gè)蛋白在處理組表達(dá)上調(diào)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示這些蛋白主要涉及蛋白翻譯、tRNA-氨酰化、細(xì)胞周期調(diào)控、脂肪酸代謝、氧化作用、DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄、氨基酸代謝、碳水化合物和核酸代謝等生理過程。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法從mRNA轉(zhuǎn)錄水平對(duì)其中的4個(gè)蛋白質(zhì)(Eno、AccA、SecA、GrpE)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中3種蛋白的mRNA表達(dá)水平均與蛋白表達(dá)水平相一致,而SecA的mRNA表達(dá)情況與蛋白質(zhì)表達(dá)情況相反。 結(jié)論：(1)建立了肺炎鏈球菌膜蛋白圖譜,以及萬古霉素處理組與對(duì)照組的雙向電泳圖譜,通過分析處理組與對(duì)照組肺炎鏈球菌總蛋白的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要涉及翻譯、核酸和糖代謝、細(xì)胞周期調(diào)控等功能,對(duì)萬古霉素的抑菌作用機(jī)制有了進(jìn)一步的了解。 (2)釕配合物X-03對(duì)肺炎鏈球菌的生長(zhǎng)具有抑制作用,且對(duì)宿主細(xì)胞的毒性很低。通過分析處理組與對(duì)照組肺炎鏈球菌總蛋白的表達(dá)變化,推測(cè)X-03可能通過抑制細(xì)菌的脂肪酸合成、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等途徑,從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。根據(jù)ICP-MS結(jié)果推測(cè),釕配合物X-03可能競(jìng)爭(zhēng)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)通路或結(jié)合位點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R378

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 范海鳴;劉艷霞;;線粒體ATP合酶中寡霉素敏感相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥學(xué)雜志;2008年09期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 范海鳴;大鼠寡霉素敏感相關(guān)蛋白的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

2 張建紅;大鼠寡霉素敏感相關(guān)蛋白的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

，

本文編號(hào)：2440749