【摘要】：Ndrg2基因是本課題組用消減雜交法從人腦內(nèi)克隆得到的一個(gè)抑癌基因,它定位于染色體14q11.2,mRNA全長2024bp,編碼357個(gè)氨基酸,分子量約為43KD的蛋白質(zhì),1999年,再次分離到人Ndrg2另一種亞型,編碼含有375個(gè)氨基酸殘基。Ndrg2定位于細(xì)胞胞漿,也報(bào)道定位于胞核。我們以往的研究主要集中在Ndrg2是一個(gè)抑制癌候選基因。NDRG2作為NDRG家族成員之一,多種腫瘤中表達(dá)降低,同時(shí)提高Ndrg2的表達(dá)能抑制腫瘤生長。是與細(xì)胞生長發(fā)育和分化增殖調(diào)控相關(guān)的重要基因細(xì)胞增殖分化相關(guān)的基因。神經(jīng)發(fā)生同樣也經(jīng)歷了神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖,細(xì)胞遷移,神經(jīng)細(xì)胞分化。我們會(huì)提出Ndrg2是否對神經(jīng)發(fā)生具有一定的作用。NDRG家族同源性很高,有研究表明NDRG1是腦發(fā)育相關(guān)基因,我們推測NDRG2是否也與腦發(fā)育相關(guān)。 近年來研究表明在胚胎早期神經(jīng)管神經(jīng)上皮中存在大量能夠增值分化的多潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞即神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞增殖、存活和分化的過程稱為神經(jīng)發(fā)生。多種動(dòng)物成體腦組織中存在著進(jìn)行性的神經(jīng)發(fā)生,可產(chǎn)生新的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細(xì)胞比較集中的一個(gè)重要區(qū)域是室管膜前下區(qū)(anterior subventricular zone,SVZa)。成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生持續(xù)存在于前腦的兩個(gè)區(qū)域:海馬齒狀回的亞顆粒層(subgranular zone,SGZ)和腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)。SVZa來源的NSCs不僅具備所有神經(jīng)干細(xì)胞的共性,而且此處神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生后,將沿著一條特定的遷移通道-喙側(cè)遷移流(rostral migratory stream,RMS)朝嗅腦(球)遷移,在遷移過程中始終保持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元前體細(xì)胞的特征而不進(jìn)一步分化,到達(dá)其遷移終點(diǎn)后才進(jìn)一步分化為成熟的神經(jīng)元,成為嗅腦球中間神經(jīng)元終生更新的來源,這也是SVZa神經(jīng)干細(xì)胞有別于其他來源神經(jīng)干細(xì)胞的主要特征。已經(jīng)有報(bào)道Ndrg2在胚胎及出生后許多組織有較高的表達(dá),在腦組織表達(dá)較高。但是就胚胎和出生后腦組織Ndrg2的分布表達(dá)模式及功能還不清楚。 我們用腦切片的原位雜交技術(shù)(ISH)結(jié)合免疫組織化學(xué)(ICH),研究Ndrg2在胚胎發(fā)育期和出生后Ndrg2在神經(jīng)發(fā)生區(qū)的表達(dá)情況。選定并觀察了Ndrg2在腦發(fā)育中的表達(dá)變化規(guī)律,探討Ndrg2在正常神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)育及神經(jīng)管發(fā)育過程中的作用,進(jìn)一步探討Ndrg2在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育過程中的作用。 方法:采用地高辛配基標(biāo)記的Ndrg2探針,就胚胎10.5d,11.5d,12.5d,14.5d,16.5d,18.5d,P0,P7,P14,adult進(jìn)行RNA原位雜交,通過檢測胚胎組織中mRNA的存在狀況來觀察基因的表達(dá)。我們利用Ndrg2在側(cè)腦室VZ、SVZ、吻側(cè)遷移流RMS、海馬的SGZ區(qū)的表達(dá)結(jié)合免疫熒光染色BrdU,Ki67,Nestin,DCX,GFAP進(jìn)行雙標(biāo)。結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察、圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等手段,觀察在發(fā)育不同階段的大鼠腦內(nèi)Ndrg2的表達(dá)情況及SVZa神經(jīng)干細(xì)胞喙側(cè)遷移流通路上Ndrg2的分布表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、Ndrg2在小鼠胚胎腦發(fā)育中的空間定位 1. E10.5d后小鼠胚胎各個(gè)器官組織形成分化原基,細(xì)胞快速增殖,即出現(xiàn)Ndrg2中樞神經(jīng)系統(tǒng)最初的三個(gè)腦泡以及分化后的端腦、間腦、后腦均有所表達(dá),并在相應(yīng)的細(xì)胞增殖部位富集,且主要分布于室管膜區(qū)VZ。提示Ndrg2可能參與了神經(jīng)管的關(guān)閉,并在神經(jīng)胚形成發(fā)揮功能作用。 2.神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生和大腦皮質(zhì)正常結(jié)構(gòu)的形成是通過細(xì)胞遷移,使得最初構(gòu)成神經(jīng)管壁全部的單層神經(jīng)管上皮細(xì)胞分化出皮質(zhì)六層結(jié)構(gòu)的過程。在這一過程中,我們觀察到NDRG2的表達(dá)在胚胎發(fā)育的早期就出現(xiàn)在室管膜層的神經(jīng)管上皮細(xì)胞內(nèi),繼而隨著上述的遷移過程,相繼表達(dá)于邊緣層,Ndrg2在皮層的表達(dá)出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。為進(jìn)一步觀察NDRG2在側(cè)腦室VZ的動(dòng)態(tài)表達(dá)。我們主要觀察大腦皮層的發(fā)育。在10.5天,Ndrg2在腦室層VZ有表達(dá),在E11.5天NDRG2表達(dá)同10.5天(圖3A).在E12. 5天,NDRG2在VZ保持高的表達(dá),但是在邊緣層檢測到低表達(dá)(圖3C)。隨著皮質(zhì)的發(fā)育,大腦皮質(zhì)的逐漸增厚,NDRG2不同的表達(dá)從深層向淺層遷移。從E14.5天到E16.5天(圖D, E)在VZ,SVZ,CP檢測到NDRG2強(qiáng)表達(dá),在IZ,SP,MZ中度表達(dá)。在E18.5天(圖3F),在VZ,SVZ保持高表達(dá),而在其他各層表達(dá)較低。這種表達(dá)模式在P0和P7沒有改變。 3.為了進(jìn)一步探討Ndrg2在腦室層細(xì)胞的分布,定位。在胚胎E11.5天的腦室層,我們用Ndrg2原位雜交與免疫組化雙標(biāo)。圖4為Ndrg2原位雜交與BrdU、Ki67、Nestin在腦室層的雙標(biāo)。Ndrg2為綠色偽彩,BrdU、Ki67、Nestin為紅色,大約90%的BrdU、Ki67陽性細(xì)胞表達(dá)Ndrg2,我們發(fā)現(xiàn)大部分表達(dá)Ndrg2的細(xì)胞在VZ層同時(shí)被Nestin標(biāo)記。在側(cè)腦室的VZ層內(nèi)側(cè),有較多的雙標(biāo)細(xì)胞,隨著腦發(fā)育雙標(biāo)細(xì)胞逐漸減少。以上進(jìn)一步說明在Ndrg2在VZ的神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)。 二、Ndrg2在出生后小鼠腦組織中的空間定位 1.采用腦切片的原位分子雜交、免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Ndrg2表達(dá)時(shí)空模式。在側(cè)腦室的室管膜區(qū)(VZ),腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ),海馬齒狀回的亞顆粒層(subgranular zone,SGZ)都表達(dá)Ndrg2較強(qiáng)的信號。提示Ndrg2主要參與了出生后小鼠腦組織的神經(jīng)發(fā)生。 2.采用上述原位雜交結(jié)合免疫熒光BrdU、DCX、GFAP標(biāo)記技術(shù)分析結(jié)果顯示,小鼠腦組織的側(cè)腦室,同時(shí)在腦室下區(qū)(SVZ),齒狀回的顆粒下層(SGZ),吻側(cè)遷移流RMS有原位雜交Ndrg2/BrdU強(qiáng)雙標(biāo)信號。在海馬齒狀回的顆粒下層,作為海馬神經(jīng)前體細(xì)胞集中的部位,增值分化為神經(jīng)元,有Ndrg2/BrdU的雙標(biāo)細(xì)胞,同時(shí)有Ndrg2/DCX雙標(biāo)的神經(jīng)元前體細(xì)胞,有Ndrg2 /GFAP雙標(biāo)的膠質(zhì)細(xì)胞,除了SVZ、SGZ、RMS外,在腦組織其他部位Ndrg2/GFAP雙標(biāo)較少。 三、Ndrg2在脊髓、小腦、視網(wǎng)膜組織中的表達(dá) 1.脊髓:Ndrg2在脊髓的灰質(zhì)有廣范的表達(dá),同時(shí)從E11.5-E18.5在中央管的室管膜層有強(qiáng)表達(dá)。Ndrg2的表達(dá)主要在脊髓的腹側(cè)有表達(dá)強(qiáng)的信號,背側(cè)陽性信號較弱,在新生鼠(P0)檢測Ndrg2陽性信號很弱。Ndrg2分布在E12.5脊髓的VZ的背部低表達(dá),而在VZ的腹側(cè)高表達(dá)。BrdU染色細(xì)胞的數(shù)量在背側(cè)區(qū)域比腹側(cè)明顯多。在腹側(cè)有少數(shù)細(xì)胞雙標(biāo)。 2.小腦:Ndrg2在E14.5d時(shí),在小腦原基和第四腦室的室管膜層有表達(dá)。在出生后,小腦皮層包括四層:外層顆粒細(xì)胞層(EGL),分子層(MCL),蒲肯野細(xì)胞層(PCL)、內(nèi)顆粒層(IGL)。外顆粒層分化、遷移穿過分子層、蒲肯野細(xì)胞層形成內(nèi)顆粒層(Goldowitz and Hamre, 1998)。Ndrg2在出生后7、14天(P7、P14)在蒲肯野細(xì)胞層有強(qiáng)的信號,同時(shí)在P14在分子層、內(nèi)顆粒層可見Ndrg2表達(dá)。所以EGL是產(chǎn)生小腦顆粒細(xì)胞的過渡增殖層,BrdU標(biāo)記在這一層,Ndrg2在出生后7、14天(P7、P14)主要在蒲肯野細(xì)胞層有強(qiáng)的信號。在蒲肯野細(xì)胞層僅有少數(shù)雙標(biāo)細(xì)胞。 3.視網(wǎng)膜:在E11.5在視網(wǎng)膜全層有Ndrg2強(qiáng)的陽性信號,隨著胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育,Ndrg2局限于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層,外層表達(dá)漸弱。ONB產(chǎn)生視網(wǎng)膜各類細(xì)胞,處于增殖期,BrdU在這一層標(biāo)記。在視網(wǎng)膜外層有少數(shù)細(xì)胞雙標(biāo)。 Ndrg2在小腦,視網(wǎng)膜,脊髓的表達(dá)并沒有在增殖細(xì)胞層,大腦皮層中等表達(dá),所以Ndrg2主要在有絲分裂后神經(jīng)元表達(dá)。 結(jié)論 1.Ndrg2在胚胎腦組織中分布在包括端腦、間腦、后腦、海馬、脊髓的室管膜區(qū)(VZ)區(qū)強(qiáng)表達(dá)。主要在VZ層的神經(jīng)前體細(xì)胞集中。 2.Ndrg2在出生后腦組織的側(cè)腦室、海馬、小腦、嗅球、紋狀體、丘腦表達(dá)較強(qiáng)的信號,并且陽性局限于側(cè)腦室的SVZ、吻側(cè)遷移流、海馬的SGZ表達(dá)較強(qiáng)。 3.Ndrg2在出生后小腦PCL,視網(wǎng)膜INB有強(qiáng)表達(dá),脊髓腹側(cè)表達(dá)。在大腦皮層中等表達(dá),這些部位是有絲分裂后神經(jīng)元分化的部位。說明Ndrg2在有絲分裂后及成熟神經(jīng)元有表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2439265