【摘要】：Ndrg2基因是本課題組用消減雜交法從人腦內(nèi)克隆得到的一個抑癌基因,它定位于染色體14q11.2,mRNA全長2024bp,編碼357個氨基酸,分子量約為43KD的蛋白質(zhì),1999年,再次分離到人Ndrg2另一種亞型,編碼含有375個氨基酸殘基。Ndrg2定位于細胞胞漿,也報道定位于胞核。我們以往的研究主要集中在Ndrg2是一個抑制癌候選基因。NDRG2作為NDRG家族成員之一,多種腫瘤中表達降低,同時提高Ndrg2的表達能抑制腫瘤生長。是與細胞生長發(fā)育和分化增殖調(diào)控相關的重要基因細胞增殖分化相關的基因。神經(jīng)發(fā)生同樣也經(jīng)歷了神經(jīng)上皮細胞增殖,細胞遷移,神經(jīng)細胞分化。我們會提出Ndrg2是否對神經(jīng)發(fā)生具有一定的作用。NDRG家族同源性很高,有研究表明NDRG1是腦發(fā)育相關基因,我們推測NDRG2是否也與腦發(fā)育相關。 近年來研究表明在胚胎早期神經(jīng)管神經(jīng)上皮中存在大量能夠增值分化的多潛能的神經(jīng)前體細胞即神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞增殖、存活和分化的過程稱為神經(jīng)發(fā)生。多種動物成體腦組織中存在著進行性的神經(jīng)發(fā)生,可產(chǎn)生新的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細胞比較集中的一個重要區(qū)域是室管膜前下區(qū)(anterior subventricular zone,SVZa)。成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生持續(xù)存在于前腦的兩個區(qū)域:海馬齒狀回的亞顆粒層(subgranular zone,SGZ)和腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)。SVZa來源的NSCs不僅具備所有神經(jīng)干細胞的共性,而且此處神經(jīng)干細胞產(chǎn)生后,將沿著一條特定的遷移通道-喙側遷移流(rostral migratory stream,RMS)朝嗅腦(球)遷移,在遷移過程中始終保持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元前體細胞的特征而不進一步分化,到達其遷移終點后才進一步分化為成熟的神經(jīng)元,成為嗅腦球中間神經(jīng)元終生更新的來源,這也是SVZa神經(jīng)干細胞有別于其他來源神經(jīng)干細胞的主要特征。已經(jīng)有報道Ndrg2在胚胎及出生后許多組織有較高的表達,在腦組織表達較高。但是就胚胎和出生后腦組織Ndrg2的分布表達模式及功能還不清楚。 我們用腦切片的原位雜交技術(ISH)結合免疫組織化學(ICH),研究Ndrg2在胚胎發(fā)育期和出生后Ndrg2在神經(jīng)發(fā)生區(qū)的表達情況。選定并觀察了Ndrg2在腦發(fā)育中的表達變化規(guī)律,探討Ndrg2在正常神經(jīng)上皮細胞發(fā)育及神經(jīng)管發(fā)育過程中的作用,進一步探討Ndrg2在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育過程中的作用。 方法:采用地高辛配基標記的Ndrg2探針,就胚胎10.5d,11.5d,12.5d,14.5d,16.5d,18.5d,P0,P7,P14,adult進行RNA原位雜交,通過檢測胚胎組織中mRNA的存在狀況來觀察基因的表達。我們利用Ndrg2在側腦室VZ、SVZ、吻側遷移流RMS、海馬的SGZ區(qū)的表達結合免疫熒光染色BrdU,Ki67,Nestin,DCX,GFAP進行雙標。結合激光共聚焦顯微鏡觀察、圖像分析及統(tǒng)計學分析等手段,觀察在發(fā)育不同階段的大鼠腦內(nèi)Ndrg2的表達情況及SVZa神經(jīng)干細胞喙側遷移流通路上Ndrg2的分布表達情況。 實驗結果: 一、Ndrg2在小鼠胚胎腦發(fā)育中的空間定位 1. E10.5d后小鼠胚胎各個器官組織形成分化原基,細胞快速增殖,即出現(xiàn)Ndrg2中樞神經(jīng)系統(tǒng)最初的三個腦泡以及分化后的端腦、間腦、后腦均有所表達,并在相應的細胞增殖部位富集,且主要分布于室管膜區(qū)VZ。提示Ndrg2可能參與了神經(jīng)管的關閉,并在神經(jīng)胚形成發(fā)揮功能作用。 2.神經(jīng)細胞的發(fā)生和大腦皮質(zhì)正常結構的形成是通過細胞遷移,使得最初構成神經(jīng)管壁全部的單層神經(jīng)管上皮細胞分化出皮質(zhì)六層結構的過程。在這一過程中,我們觀察到NDRG2的表達在胚胎發(fā)育的早期就出現(xiàn)在室管膜層的神經(jīng)管上皮細胞內(nèi),繼而隨著上述的遷移過程,相繼表達于邊緣層,Ndrg2在皮層的表達出現(xiàn)動態(tài)變化。為進一步觀察NDRG2在側腦室VZ的動態(tài)表達。我們主要觀察大腦皮層的發(fā)育。在10.5天,Ndrg2在腦室層VZ有表達,在E11.5天NDRG2表達同10.5天(圖3A).在E12. 5天,NDRG2在VZ保持高的表達,但是在邊緣層檢測到低表達(圖3C)。隨著皮質(zhì)的發(fā)育,大腦皮質(zhì)的逐漸增厚,NDRG2不同的表達從深層向淺層遷移。從E14.5天到E16.5天(圖D, E)在VZ,SVZ,CP檢測到NDRG2強表達,在IZ,SP,MZ中度表達。在E18.5天(圖3F),在VZ,SVZ保持高表達,而在其他各層表達較低。這種表達模式在P0和P7沒有改變。 3.為了進一步探討Ndrg2在腦室層細胞的分布,定位。在胚胎E11.5天的腦室層,我們用Ndrg2原位雜交與免疫組化雙標。圖4為Ndrg2原位雜交與BrdU、Ki67、Nestin在腦室層的雙標。Ndrg2為綠色偽彩,BrdU、Ki67、Nestin為紅色,大約90%的BrdU、Ki67陽性細胞表達Ndrg2,我們發(fā)現(xiàn)大部分表達Ndrg2的細胞在VZ層同時被Nestin標記。在側腦室的VZ層內(nèi)側,有較多的雙標細胞,隨著腦發(fā)育雙標細胞逐漸減少。以上進一步說明在Ndrg2在VZ的神經(jīng)前體細胞表達。 二、Ndrg2在出生后小鼠腦組織中的空間定位 1.采用腦切片的原位分子雜交、免疫組化技術發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)Ndrg2表達時空模式。在側腦室的室管膜區(qū)(VZ),腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ),海馬齒狀回的亞顆粒層(subgranular zone,SGZ)都表達Ndrg2較強的信號。提示Ndrg2主要參與了出生后小鼠腦組織的神經(jīng)發(fā)生。 2.采用上述原位雜交結合免疫熒光BrdU、DCX、GFAP標記技術分析結果顯示,小鼠腦組織的側腦室,同時在腦室下區(qū)(SVZ),齒狀回的顆粒下層(SGZ),吻側遷移流RMS有原位雜交Ndrg2/BrdU強雙標信號。在海馬齒狀回的顆粒下層,作為海馬神經(jīng)前體細胞集中的部位,增值分化為神經(jīng)元,有Ndrg2/BrdU的雙標細胞,同時有Ndrg2/DCX雙標的神經(jīng)元前體細胞,有Ndrg2 /GFAP雙標的膠質(zhì)細胞,除了SVZ、SGZ、RMS外,在腦組織其他部位Ndrg2/GFAP雙標較少。 三、Ndrg2在脊髓、小腦、視網(wǎng)膜組織中的表達 1.脊髓:Ndrg2在脊髓的灰質(zhì)有廣范的表達,同時從E11.5-E18.5在中央管的室管膜層有強表達。Ndrg2的表達主要在脊髓的腹側有表達強的信號,背側陽性信號較弱,在新生鼠(P0)檢測Ndrg2陽性信號很弱。Ndrg2分布在E12.5脊髓的VZ的背部低表達,而在VZ的腹側高表達。BrdU染色細胞的數(shù)量在背側區(qū)域比腹側明顯多。在腹側有少數(shù)細胞雙標。 2.小腦:Ndrg2在E14.5d時,在小腦原基和第四腦室的室管膜層有表達。在出生后,小腦皮層包括四層:外層顆粒細胞層(EGL),分子層(MCL),蒲肯野細胞層(PCL)、內(nèi)顆粒層(IGL)。外顆粒層分化、遷移穿過分子層、蒲肯野細胞層形成內(nèi)顆粒層(Goldowitz and Hamre, 1998)。Ndrg2在出生后7、14天(P7、P14)在蒲肯野細胞層有強的信號,同時在P14在分子層、內(nèi)顆粒層可見Ndrg2表達。所以EGL是產(chǎn)生小腦顆粒細胞的過渡增殖層,BrdU標記在這一層,Ndrg2在出生后7、14天(P7、P14)主要在蒲肯野細胞層有強的信號。在蒲肯野細胞層僅有少數(shù)雙標細胞。 3.視網(wǎng)膜:在E11.5在視網(wǎng)膜全層有Ndrg2強的陽性信號,隨著胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育,Ndrg2局限于神經(jīng)節(jié)細胞層,外層表達漸弱。ONB產(chǎn)生視網(wǎng)膜各類細胞,處于增殖期,BrdU在這一層標記。在視網(wǎng)膜外層有少數(shù)細胞雙標。 Ndrg2在小腦,視網(wǎng)膜,脊髓的表達并沒有在增殖細胞層,大腦皮層中等表達,所以Ndrg2主要在有絲分裂后神經(jīng)元表達。 結論 1.Ndrg2在胚胎腦組織中分布在包括端腦、間腦、后腦、海馬、脊髓的室管膜區(qū)(VZ)區(qū)強表達。主要在VZ層的神經(jīng)前體細胞集中。 2.Ndrg2在出生后腦組織的側腦室、海馬、小腦、嗅球、紋狀體、丘腦表達較強的信號,并且陽性局限于側腦室的SVZ、吻側遷移流、海馬的SGZ表達較強。 3.Ndrg2在出生后小腦PCL,視網(wǎng)膜INB有強表達,脊髓腹側表達。在大腦皮層中等表達,這些部位是有絲分裂后神經(jīng)元分化的部位。說明Ndrg2在有絲分裂后及成熟神經(jīng)元有表達。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【參考文獻】

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本文編號：2439265