發(fā)布時間：2019-03-05 21:10

【摘要】：背景：骺板損傷占小兒全部長管狀骨骨折的15%-30%，10%的骺板損傷將導致骨骼及關節(jié)畸形發(fā)育，不但給兒童心理帶來嚴重影響，而且影響肢體功能，甚至喪失勞動能力[1]。組織工程技術的發(fā)展為治療骺板損傷帶來新的希望，大多數(shù)學者將重點放在組織工程骺板的構建上，并取得初步的成功。因為獲得容易，人們最初將注意力放在軟骨細胞上，，但研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞在體外擴增培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)去分化和生物學功能衰退，并以合成和分泌軟骨基質能力下降或消失為標志，因此具有生長潛力的軟骨母細胞一骺板軟骨細胞成為新的研究熱點。目的：體外培養(yǎng)兔骺板軟骨細胞，探索簡便、高效的細胞培養(yǎng)方法。對培養(yǎng)細胞進行初步研究，觀察細胞鏡下形態(tài)、電鏡下細胞超微結構，鑒定細胞是否分泌蛋白聚糖及其含量，鑒定細胞是否能合成II型膠原蛋白及是否表達相應mRNA。為骺板組織工程尋找良好的種子細胞，為下一步基因轉染結合支架材料修復骺板損傷提供實驗基礎。 方法：選取3周齡新西蘭幼兔18只、雌雄不限、健康，體重約250-300g。分別切取三個部位的軟骨(①股骨遠端及脛骨近端的骺板軟骨;②髂骨;③肋軟骨，經(jīng)改良三步酶消化獲得細胞。將獲得軟骨細胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中原代、傳代體外培養(yǎng)。分別取細胞懸液計算細胞產(chǎn)量和細胞成活率并用倒置顯微鏡及透射電鏡觀察培養(yǎng)細胞形態(tài)及超微結構，觀察細胞生長狀態(tài)。MTT四唑鹽比色法檢測不同代次骺板軟骨細胞生長活性。Alcian blue染色確定培養(yǎng)細胞有蛋白聚糖生成及定量檢測，免疫組織化學染色檢測II型膠原蛋白產(chǎn)生， PCR證實細胞有II型膠原蛋白mRNA生成。 結果：本實驗方法體外培養(yǎng)幼兔骺板軟骨細胞，收集過程簡便、高效。培養(yǎng)過程中觀察到股骨遠端及脛骨近端的骺板軟骨細胞在單位重量的細胞產(chǎn)量、生長速度和分化速度上優(yōu)于髂骨、肋軟骨細胞，但在生物學形態(tài)上，三個部位的細胞無明顯差別。骺板軟骨細胞貼壁生長及傳代的生長全過程，多次傳代后細胞增殖能力逐漸降低，細胞形態(tài)逐漸向“纖維化”細胞轉變。前3代細胞具有較高的生物學及功能學特性表達。從第4代以后細胞形態(tài)改變逐漸喪失骺板軟骨細胞特有結構，軟骨細胞所特有的II型膠原及蛋白多糖漸消失，出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。PCR檢測有II型膠原mRNA的表達、Alcian blue染色顯示第3代細胞蛋白聚糖含量高，MTT顯示第2、3、4代細胞生長曲線呈倒“S”型，第2、3代細胞活性明顯優(yōu)于第4代，培養(yǎng)細胞均于第10天出現(xiàn)生長抑制。 結論：1.兔骺板軟骨細胞通過改良三步酶消化法獲取方便，消化較徹底，存活率高，可獲取大量骺板軟骨細胞。2.體外培養(yǎng)的幼兔骺板軟骨細胞前3代表型穩(wěn)定，生物學及功能學特性表達良好，體外培養(yǎng)第2代、第3代細胞更適合作為骺板組織工程種子細胞來源。3.成功地建立了骺板軟骨細胞的體外培養(yǎng)方法，并證實所培養(yǎng)出的細胞是骺板軟骨細胞，為下一步基因轉染結合支架材料修復骺板損傷提供實驗基礎。4.股骨遠端及脛骨近端的骺板軟骨細胞在單位重量的細胞產(chǎn)量、生長速度和分化速度上優(yōu)于髂骨、肋軟骨細胞，但在生物學形態(tài)上，三個部位的細胞無明顯差別。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329.24

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周強,李起鴻,戴剛,楊柳;經(jīng)離心管培養(yǎng)骺軟骨異體修復兔骺板部分損傷的初步觀察[J];第三軍醫(yī)大學學報;2001年10期

2 周強,李起鴻,戴剛,楊柳;高數(shù)量骺板軟骨細胞聚集培養(yǎng)生成軟骨組織的觀察[J];第三軍醫(yī)大學學報;2002年05期

3 王金成,尹飛,郭麗,段德生,高忠禮;兔髂骨骺板軟骨細胞體外構建骺板樣軟骨組織[J];骨與關節(jié)損傷雜志;2003年05期

4 付勤;于冬冬;王勇;宮樹一;;TGF-β1基因轉染大鼠脂肪干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2007年06期

5 夏萬堯;丁文龍;劉偉;鐘梅芳;周廣東;崔磊;曹誼林;;重組hTGF-β1腺病毒轉染BMSCs及對其增殖的影響[J];解剖科學進展;2009年01期

6 何清義,李起鴻,許建中,楊柳;轉化軟骨細胞與正常軟骨細胞的生物特性比較[J];中國臨床康復;2002年10期

7 李卿,陸峻泓,劉偉,夏萬堯,劉德莉,崔磊,曹誼林;軟骨細胞的老化對軟骨蛋白聚糖代謝的影響[J];中國臨床康復;2003年02期

8 張仲文,陳崢嶸,楊傳鐸,金建軍,胡美玉;兔關節(jié)軟骨細胞在藻酸鹽串珠中培養(yǎng)維持其表型穩(wěn)定的研究[J];中國臨床康復;2003年04期

9 劉瑞平;范衛(wèi)民;高共鳴;馬益民;;腺病毒介導的hIGF-Ⅰ基因轉染對構建組織工程軟骨的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2009年01期

10 蔣欣泉;常慶;張秀麗;張志愿;;骨形成蛋白2基因修飾的山羊耳軟骨細胞體內異位植入研究[J];中國口腔頜面外科雜志;2008年01期

本文編號：2435293