【摘要】：背景：骺板損傷占小兒全部長管狀骨骨折的15%-30%，10%的骺板損傷將導(dǎo)致骨骼及關(guān)節(jié)畸形發(fā)育，不但給兒童心理帶來嚴(yán)重影響，而且影響肢體功能，甚至喪失勞動能力[1]。組織工程技術(shù)的發(fā)展為治療骺板損傷帶來新的希望，大多數(shù)學(xué)者將重點(diǎn)放在組織工程骺板的構(gòu)建上，并取得初步的成功。因?yàn)楂@得容易，人們最初將注意力放在軟骨細(xì)胞上，，但研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)去分化和生物學(xué)功能衰退，并以合成和分泌軟骨基質(zhì)能力下降或消失為標(biāo)志，因此具有生長潛力的軟骨母細(xì)胞一骺板軟骨細(xì)胞成為新的研究熱點(diǎn)。目的：體外培養(yǎng)兔骺板軟骨細(xì)胞，探索簡便、高效的細(xì)胞培養(yǎng)方法。對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行初步研究，觀察細(xì)胞鏡下形態(tài)、電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，鑒定細(xì)胞是否分泌蛋白聚糖及其含量，鑒定細(xì)胞是否能合成II型膠原蛋白及是否表達(dá)相應(yīng)mRNA。為骺板組織工程尋找良好的種子細(xì)胞，為下一步基因轉(zhuǎn)染結(jié)合支架材料修復(fù)骺板損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：選取3周齡新西蘭幼兔18只、雌雄不限、健康，體重約250-300g。分別切取三個部位的軟骨(①股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端的骺板軟骨;②髂骨;③肋軟骨，經(jīng)改良三步酶消化獲得細(xì)胞。將獲得軟骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中原代、傳代體外培養(yǎng)。分別取細(xì)胞懸液計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞成活率并用倒置顯微鏡及透射電鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。MTT四唑鹽比色法檢測不同代次骺板軟骨細(xì)胞生長活性。Alcian blue染色確定培養(yǎng)細(xì)胞有蛋白聚糖生成及定量檢測，免疫組織化學(xué)染色檢測II型膠原蛋白產(chǎn)生， PCR證實(shí)細(xì)胞有II型膠原蛋白mRNA生成。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)方法體外培養(yǎng)幼兔骺板軟骨細(xì)胞，收集過程簡便、高效。培養(yǎng)過程中觀察到股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端的骺板軟骨細(xì)胞在單位重量的細(xì)胞產(chǎn)量、生長速度和分化速度上優(yōu)于髂骨、肋軟骨細(xì)胞，但在生物學(xué)形態(tài)上，三個部位的細(xì)胞無明顯差別。骺板軟骨細(xì)胞貼壁生長及傳代的生長全過程，多次傳代后細(xì)胞增殖能力逐漸降低，細(xì)胞形態(tài)逐漸向“纖維化”細(xì)胞轉(zhuǎn)變。前3代細(xì)胞具有較高的生物學(xué)及功能學(xué)特性表達(dá)。從第4代以后細(xì)胞形態(tài)改變逐漸喪失骺板軟骨細(xì)胞特有結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞所特有的II型膠原及蛋白多糖漸消失，出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。PCR檢測有II型膠原mRNA的表達(dá)、Alcian blue染色顯示第3代細(xì)胞蛋白聚糖含量高，MTT顯示第2、3、4代細(xì)胞生長曲線呈倒“S”型，第2、3代細(xì)胞活性明顯優(yōu)于第4代，培養(yǎng)細(xì)胞均于第10天出現(xiàn)生長抑制。 結(jié)論：1.兔骺板軟骨細(xì)胞通過改良三步酶消化法獲取方便，消化較徹底，存活率高，可獲取大量骺板軟骨細(xì)胞。2.體外培養(yǎng)的幼兔骺板軟骨細(xì)胞前3代表型穩(wěn)定，生物學(xué)及功能學(xué)特性表達(dá)良好，體外培養(yǎng)第2代、第3代細(xì)胞更適合作為骺板組織工程種子細(xì)胞來源。3.成功地建立了骺板軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，并證實(shí)所培養(yǎng)出的細(xì)胞是骺板軟骨細(xì)胞，為下一步基因轉(zhuǎn)染結(jié)合支架材料修復(fù)骺板損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端的骺板軟骨細(xì)胞在單位重量的細(xì)胞產(chǎn)量、生長速度和分化速度上優(yōu)于髂骨、肋軟骨細(xì)胞，但在生物學(xué)形態(tài)上，三個部位的細(xì)胞無明顯差別。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329.24

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周強(qiáng),李起鴻,戴剛,楊柳;經(jīng)離心管培養(yǎng)骺軟骨異體修復(fù)兔骺板部分損傷的初步觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年10期

2 周強(qiáng),李起鴻,戴剛,楊柳;高數(shù)量骺板軟骨細(xì)胞聚集培養(yǎng)生成軟骨組織的觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年05期

3 王金成,尹飛,郭麗,段德生,高忠禮;兔髂骨骺板軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建骺板樣軟骨組織[J];骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2003年05期

4 付勤;于冬冬;王勇;宮樹一;;TGF-β1基因轉(zhuǎn)染大鼠脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2007年06期

5 夏萬堯;丁文龍;劉偉;鐘梅芳;周廣東;崔磊;曹誼林;;重組hTGF-β1腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs及對其增殖的影響[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2009年01期

6 何清義,李起鴻,許建中,楊柳;轉(zhuǎn)化軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞的生物特性比較[J];中國臨床康復(fù);2002年10期

7 李卿,陸峻泓,劉偉,夏萬堯,劉德莉,崔磊,曹誼林;軟骨細(xì)胞的老化對軟骨蛋白聚糖代謝的影響[J];中國臨床康復(fù);2003年02期

8 張仲文,陳崢嶸,楊傳鐸,金建軍,胡美玉;兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在藻酸鹽串珠中培養(yǎng)維持其表型穩(wěn)定的研究[J];中國臨床康復(fù);2003年04期

9 劉瑞平;范衛(wèi)民;高共鳴;馬益民;;腺病毒介導(dǎo)的hIGF-Ⅰ基因轉(zhuǎn)染對構(gòu)建組織工程軟骨的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2009年01期

10 蔣欣泉;常慶;張秀麗;張志愿;;骨形成蛋白2基因修飾的山羊耳軟骨細(xì)胞體內(nèi)異位植入研究[J];中國口腔頜面外科雜志;2008年01期

本文編號：2435293