發(fā)布時(shí)間：2019-03-01 18:08

【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。近年來多耐藥TB、廣泛耐藥TB的不斷出現(xiàn)和TB/AIDS疫情的加重，使得新一代抗結(jié)核藥物的開發(fā)勢在必行。以特異靶標(biāo)為基礎(chǔ)的化合物篩選是藥物開發(fā)的主要策略之一。我們可以針對已知的藥物靶標(biāo)，建立高通量篩選的方法從化合物庫中篩選抑制劑；也可以在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中探尋新的靶標(biāo)，驗(yàn)證它們對細(xì)菌生長或感染的必需性，從而為開發(fā)具有全新作用機(jī)制的抗結(jié)核藥物奠定基礎(chǔ)。 α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶(RmlA)與其它三個(gè)酶(RmlB, RmlC和RmlD)共同催化了分枝桿菌細(xì)胞壁中鼠李糖的活性供體：dTDP-鼠李糖的合成。鼠李糖是細(xì)胞壁核心結(jié)構(gòu)的重要組成成分之一，缺乏RmlA蛋白的分枝桿菌會(huì)因細(xì)胞壁合成受阻而無法生長。因此，RmlA是已被確定的、可用于抗結(jié)核藥物開發(fā)的潛在靶標(biāo)。 Rv0228是經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析預(yù)測的、抗結(jié)核藥物的候選靶點(diǎn)。Rv0228對于結(jié)核分枝桿菌生長的必需性尚未通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,其基因功能也尚不明確。 本論文的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖牵?1)為已確定的藥物靶標(biāo)RmlA建立快速有效的、可用于高通量篩選抑制劑的酶活性測定方法。利用此方法確定M. tuberculosis RmlA的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征和常數(shù)，包括初速度范圍、最適溫度、最適pH值、最適Mg~(2+)濃度以及Km和Vmax值。(2)驗(yàn)證候選的藥物靶標(biāo)Rv0228基因?qū)Ψ种U菌生長的必需性。利用Mycobacterium smegmatis mc~2155作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ骄酝粗亟M的方法敲除Rv0228的同源基因MSMEG_0319，建立MSMEG_0319基因敲除菌珠，作為Rv0228生長必需性研究的模型。通過研究MSMEG_0319基因敲除菌珠的生長情況，分析Rv0228基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌生長的必需性。(3)初步探索候選的藥物靶標(biāo)Rv0228的基因功能。利用生物信息學(xué)方法對Rv0228序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測Rv0228的功能范圍。利用溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)，獲取一定量的MSMEG_0319基因敲除菌，作為Rv0228功能研究的模型。觀察MSMEG_0319基因敲除菌在MSMEG_0319缺失時(shí)的形態(tài)變化和細(xì)胞壁糖組分變化，從而確定MSMEG_0319是否與分枝桿菌細(xì)胞壁的代謝相關(guān)。利用多種蛋白表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中表達(dá)Rv0228蛋白，篩選出高效表達(dá)Rv0228蛋白的菌珠，為獲得一定量的Rv0228蛋白純品和最終鑒定Rv0228的功能奠定基礎(chǔ)。 本文獲得如下結(jié)果： 1. RmlA酶活性方法的建立和酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析 (1) RmlA酶蛋白的表達(dá)純化：利用pET16b表達(dá)載體在大腸肝菌BL21(DE3)中表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌RmlA蛋白，并利用His-Ni~(2+)親和層析對RmlA蛋白進(jìn)行了純化。SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果顯示：純化的RmlA酶蛋白分子量大小正確，純度良好。 (2) RmlA酶蛋白的活性測定：利用傳統(tǒng)的高效液相層析(HPLC)方法對純化的RmlA蛋白進(jìn)行活性鑒定，結(jié)果顯示純化的RmlA酶蛋白具有α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶活性，催化底物dTTP和D-Glc-1-P生成了產(chǎn)物dTDP-D-Glc和PPi。 (3)高通量RmlA酶活性測定方法的建立：在RmlA酶促反應(yīng)體系中偶聯(lián)焦磷酸酶，將產(chǎn)物PPi分解為Pi，最終用孔雀石綠顯色劑顯色。結(jié)果顯示，此方法可以有效檢測RmlA酶蛋白活性。方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明，此方法樣品/空白信號(hào)比大于2，Z’值為0.7，可用于RmlA酶蛋白抑制劑的高通量篩選。 (4)結(jié)核分枝桿菌RmlA的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究：利用上述建立的孔雀石綠方法測定了結(jié)核分枝桿菌RmlA酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征和常數(shù)。結(jié)果顯示：RmlA酶促反應(yīng)的最適溫度為37℃，最適pH值為7.5，最適Mg~(2+)濃度為5mM。RmlA對底物dTTP的Km值為0.020±0.004mM，Vmax值為0.003±0.0003mM/min； RmlA對底物D-Glc-1-P的Km值為0.069±0.0050mM，Vmax值為0.002±0.0001mM/min。 (5) RmlA抑制劑的篩選：利用孔雀石綠方法對23種天然產(chǎn)物進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，23種天然產(chǎn)物對結(jié)核分枝桿菌RmlA無抑制作用。 2. Rv0228對分枝桿菌生長必需性的研究 (1) MSMEG_0319基因敲除菌珠的建立 將Kan抗性基因(kan~R)插入到MSMEG_0319基因中，產(chǎn)生突變基因MSMEG_0319::kan~R。再將此突變基因克隆到pPR27-xylE載體中，構(gòu)建出溫度敏感的條件復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-MSMEG_0319::kan~R(pMS-3)。 將Rv0228基因克隆pET23b-Phsp60載體中，然后再將Phsp60-Rv0228片段克隆到pCG76載體中，構(gòu)建出溫度敏感的營救質(zhì)粒pCG76-Phsp60-Rv0228(pMS-6)。 將pMS-3電轉(zhuǎn)化至mc~2155感受態(tài)細(xì)胞中，在溫度和抗生素的選擇性壓力下，pMS-3上的突變基因MSMEG_0319::kan~R與mc~2155基因組上的MSMEG_0319發(fā)生第一次同源重組，突變基因MSMEG_0319::kan~R整合至mc~2155的基因組中。Southern blot篩選出7個(gè)第一次同源重組正確的突變菌mc~2155MS-1。將營救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至mc~2155MS-1中，在蔗糖的選擇性壓力下，mc~2155MS-1基因組自身發(fā)生第二次同源重組，剔除正常的MSMEG_0319基因，只保留突變基因MSMEG_0319::kan~R。Southern blot篩選出7個(gè)第二次同源重組正確的突變菌mc~2155MS-2，即為MSMEG_0319基因敲除菌珠。 (2) MSMEG_0319基因敲除菌珠生長曲線的繪制 以MSMEG_0319基因敲除菌珠作為Rv228基因必需性研究的模型，測定MSMEG_0319基因敲除菌株在30C和42C培養(yǎng)時(shí)的生長曲線，結(jié)果顯示MSMEG_0319基因敲除菌株在30C可以生長，在42C條件下不能生長；然而，對照菌(攜帶pCG76質(zhì)粒的mc~2155)在30C和42C條件下均可正常生長。此結(jié)果表明Rv0228是分枝桿菌生長的必需基因。 3.初步探索Rv0228基因的功能 (1) Rv0228的生物信息學(xué)分析：利用基因信息的數(shù)據(jù)庫查看Rv0228基因組上相鄰基因的功能；利用序列比對分析搜尋Rv0228同源蛋白，查看它們的功能及種屬來源。結(jié)果顯示：Rv0228在基因組中存在于單獨(dú)的操縱子中，相鄰基因多與細(xì)胞壁代謝相關(guān)；Rv0228在結(jié)核分枝桿菌及放線菌門的某些菌屬中具有同源基因，在人類細(xì)胞、其它原核生物以及放線菌門的鏈霉菌中沒有同源基因�？偨Y(jié)這些信息，推測Rv0228基因的功能可能與結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁肽聚糖以外的結(jié)構(gòu)代謝相關(guān)。 (2)獲取MSMEG_0319基因敲除菌作為Rv0228功能研究的模型：利用溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)，先將MSMEG_0319基因敲除菌置于30℃培養(yǎng)20小時(shí)，允許其中的營救質(zhì)粒復(fù)制并表達(dá)Rv0228蛋白以補(bǔ)償缺失的MSMEG_0319基因功能，然后將培養(yǎng)溫度升高至42℃，此時(shí)營救質(zhì)粒不再復(fù)制和表達(dá)Rv0228蛋白，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，敲除菌內(nèi)的Rv0228蛋白逐漸消耗，整個(gè)細(xì)菌也逐漸表現(xiàn)出缺乏MSMEG_0319基因功能產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞組分的變化。利用此方法我們收集到了一定量MSMEG_0319蛋白缺失的MSMEG_0319基因敲除菌敲除菌，作為Rv0228功能研究的模型。 (3) MSMEG_0319基因敲除菌形態(tài)的觀察：利用掃描電鏡觀察溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)獲得的MSMEG_0319基因敲除菌，結(jié)果顯示，，敲除菌在轉(zhuǎn)換至42C生長72小時(shí)后出現(xiàn)形態(tài)改變，局部膨大、大小不一、表面出現(xiàn)皺褶；144小時(shí)后，MSMEG_0319基因敲除菌細(xì)菌形態(tài)改變更加明顯，細(xì)菌形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面出現(xiàn)大量刺狀突起，極不光滑。同時(shí)，持續(xù)在30C生長72小時(shí)和144小時(shí)的MSMEG_0319基因敲除菌形態(tài)正常，與野生型mc~2155無明顯差別。利用透射電鏡觀察溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)獲得的MSMEG_0319基因敲除菌，結(jié)果顯示，敲除菌在轉(zhuǎn)換至42C生長144小時(shí)時(shí)，細(xì)胞壁不再完整，出現(xiàn)明顯破損，并可觀察到胞質(zhì)溢出。掃描電鏡和透射電鏡的結(jié)果表明，Rv0228基因?qū)Ψ种U菌的生長至關(guān)重要，其功能可能與細(xì)胞壁合成有關(guān)。 (4) MSMEG_0319基因敲除菌細(xì)胞壁糖組分含量分析：提取溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)獲得的MSMEG_0319基因敲除菌和野生型mc~2155的細(xì)胞壁核心結(jié)構(gòu)mAGP，利用HPLC測定聚阿拉伯糖半乳糖層中半乳糖和肽聚糖層中胞壁酸的含量。結(jié)果顯示，MSMEG_0319基因敲除菌中半乳糖與胞壁酸的比值明顯低于野生型mc~2155。此結(jié)果說明，Rv0228的基因功能可能與分枝桿菌細(xì)胞壁聚半乳糖的形成直接或間接相關(guān)。 (5) R0228蛋白的表達(dá)：構(gòu)建了pET29b-Rv0228, pET16b-Rv0228, pBAD-Rv0228-C和pBAD-Rv0228-N表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)Rv0228蛋白；同時(shí)構(gòu)建了pVV16-Rv0228表達(dá)質(zhì)粒，在恥垢分枝桿菌中表達(dá)Rv0228蛋白。Dot blot檢測結(jié)果顯示，攜帶pET16b-Rv0228的E. coli C41(DE3)和E. coli ER2566菌珠以及攜帶pBAD-RV0228-N的E. coli TOP10菌珠可以高效表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Rv0228蛋白。 結(jié)論： 1.利用pET16b表達(dá)載體在E. coli BL21(DE3)中高效表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌RmlA酶蛋白，純化后的RmlA酶蛋白具有α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶活性。 2.通過偶聯(lián)焦磷酸酶和使用孔雀石綠顯色，建立了快速有效且穩(wěn)定可靠的、可用于高通量篩選RmlA抑制劑的RmlA酶活性檢測方法(孔雀石綠法)。 3.利用孔雀石綠法確定了RmlA酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征和常數(shù)，包括最適溫度、最適pH、最適Mg~(~(~(2+)))濃度，以及RmlA酶對反應(yīng)底物的Km和Vmax值。 4.以恥垢分枝桿菌mc~2155作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ骄猛粗亟M的方法敲除了結(jié)核分枝桿菌候選靶標(biāo)Rv0228的同源基因：MSMEG_0319，建立了MSMEG_0319基因敲除菌珠，作為Rv0228生長必需性研究的模型。通過觀察MSMEG_0319基因敲除菌珠的生長情況，確定了Rv0228是分枝桿菌生長的必需基因。 5.通過生物信息學(xué)方法對Rv0228的功能進(jìn)行分析預(yù)測，確定了Rv0228的功能可能與結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁肽聚糖以外的結(jié)構(gòu)代謝相關(guān)。 6.通過溫度轉(zhuǎn)換(從30℃到42℃)實(shí)驗(yàn)，獲得了一定量的MSMEG_0319基因敲除菌，作為Rv0228基因功能研究的模型。利用掃描電鏡和透射電鏡觀察了MSMEG_0319基因敲除菌在缺失MSMEG_0319蛋白功能時(shí)的形態(tài)變化，并通過HPLC分析了它們細(xì)胞壁中半乳糖和胞壁酸含量比值的變化，從而確定了Rv0228的功能可能與結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中聚半乳糖的形成直接或間接相關(guān)。 7.利用不同的表達(dá)載體在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中表達(dá)Rv02228蛋白，篩選得到了3個(gè)高效表達(dá)Rv0228蛋白的大腸桿菌菌珠：攜帶pET16b-Rv0228的E. coliC41(DE3)菌珠、攜帶pET16b-Rv0228的E. coli ER2566菌珠、以及攜帶pBAD-Rv0228-N的E. coli TOP10菌珠。 未來的研究方向： 1.對于已知的藥物靶標(biāo)RmlA可開展如下工作： (1)利用孔雀石綠顯色的方法，從小分子化合物庫中篩選RmlA酶蛋白抑制劑。 (2)優(yōu)化RmlA酶蛋白的表達(dá)條件，獲得更大量的RmlA純化蛋白進(jìn)行RmlA的結(jié)構(gòu)研究，根據(jù)RmlA酶蛋白的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)或挑選合適的小分子化合物進(jìn)行RmlA抑制作用的測試。 2.對于候選靶標(biāo)Rv0228可開展如下工作： (1)利用MSMEG_0319基因敲除菌珠作為功能研究的模型，通過測定細(xì)胞壁中更多單糖成分如阿拉伯糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺的含量變化，從而分析Rv0228的具體功能。 (2)利用Rv0228高效表達(dá)菌珠在大體積培養(yǎng)基中大量表達(dá)Rv0228蛋白，提取細(xì)菌膜組分并純化Rv0228蛋白，同時(shí)建立�；D(zhuǎn)移酶的酶活性測定方法，為Rv0228功能的最終確定奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378.911

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5 劉娟;抗EV71病毒藥物靶標(biāo)的篩選與驗(yàn)證[D];北京工業(yè)大學(xué);2012年

6 劉凱;一類新型2-卞硫基-5-芳基VA二唑衍生物的合成及生物活性研究[D];南京大學(xué);2012年

7 周強(qiáng);基于配體結(jié)構(gòu)的藥物靶標(biāo)預(yù)測及細(xì)胞色素P450酶代謝底物數(shù)據(jù)庫CYP-Meta的構(gòu)建[D];上海交通大學(xué);2012年

8 畢繼才;結(jié)核分枝桿菌NAD生物合成酶NaMNAT（Rv2421c）的分子伴侶功能[D];西南大學(xué);2011年

9 陳廷威;基于公共數(shù)據(jù)庫的藥物靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)研究[D];山東大學(xué);2012年

10 張玉勝;細(xì)菌基因組中脂類代謝的比較[D];山東理工大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2432675