【摘要】：子宮內膜接受胚胎著床的能力稱為子宮內膜容受性。人類子宮內膜只在月經周期的20-24天具備接受胚胎植入的能力,稱為“子宮內膜容受窗期”。在這一時期,子宮內膜在下丘腦-垂體-卵巢軸的精確調控下發(fā)生了特殊的形態(tài)、生理和分子生物學的變化來易化胚胎植入。子宮內膜容受性的建立是胚胎成功植入的決定因素,任何原因引起的子宮內膜容受性不能建立或建立延遲,都會導致胚胎著床失敗。輔助生殖技術(ART)是解決人類不孕的重要手段,但試管嬰兒技術(IVF)發(fā)明至今其成功率仍在20-30%徘徊。人們認為子宮內膜容受性缺陷大約占導致著床失敗原因的2/3,而胚胎原因僅占1/3,無法診斷和治療子宮內膜容受性異常也是ART成功的主要障礙。因此,容受性的診斷和評估對提高輔助生殖技術的成功率具有極其重要的臨床意義。尋找子宮內膜容受窗期特異性表達的標志分子,闡明子宮內膜容受性形成的分子機制,將極大地推動生殖醫(yī)學的進步。 隨著高通量篩選技術的發(fā)展,前期有許多研究應用基因組學及蛋白質組學技術來尋找子宮內膜容受性形成的標志分子。然而,由于樣本量的限制、樣本來源的不同、數據本身的高維度及分析方法和分析標準的差異,這些高通量篩選得出的結果并不一致。目前,可靠的子宮內膜容受性標志分子仍然沒有找到,子宮內膜容受性的分子機制仍不清楚。重復高通量篩選無疑是一件既費錢又費力的事,而前期大量高通量篩選堆積了大量數據并沒有得到充分利用。生物信息學的發(fā)展為我們有效利用前人的數據提供了平臺,不僅可以避免浪費,而且從一定程度上擴大了樣本量,增加了數據的可靠性。本研究的第一部分應用生物信息學的方法整合多中心數據進行分析,挖掘出在子宮內膜容受窗期特異表達的分子作為標志分子,并進一步驗證部分分子在著床窗口期的表達規(guī)律,為尋找容受性標志分子及進一步研究子宮內膜容受形成的分子機制提供線索。 胚胎著床過程包括胚胎在子宮內膜上定位、粘附與侵入等環(huán)節(jié),該過程涉及細胞的增生、凋亡、粘附、侵襲和血管增生等細胞學行為。S100P是本課題在前期生物信息學挖掘中發(fā)現的在容受窗期子宮內膜特異性表達上調的分子。已知該分子廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,與腫瘤細胞的增生、侵襲、轉移、及血管生成有關,然而該分子與子宮內膜容受性形成的關系及在胚胎著床過程中的作用及機制目前還鮮有報道。本研究第二部分進一步觀察S100P在子宮內膜和胎盤中的時空表達規(guī)律、P激素調節(jié),并用RNA干擾和過表達技術探討S100P在子宮內膜容受性建立中的作用及可能機制。本研究將有助于我們更好的理解胚胎植入伊始子宮內膜容受性建立的分子機制。 第一部分子宮內膜容受性標志分子的生物信息學挖掘與分析 目的： 1、從現有的基因芯片數據庫中挖掘子宮內膜容受窗期特異表達的分子,為尋找子宮內膜容受窗期標志分子提供線索。 2、運用功能分析及相互作用網絡分析方法,分析這些差異表達基因的功能及其相互作用網絡,以進一步了解子宮內膜容受形成的分子機制。 3、收集臨床標本驗證生物信息學挖掘的結果。 材料與方法： 1、應用生物信息學軟件GeneSifter從現有的基因芯片數據庫中挖掘篩選在子宮內膜容受窗期特異性表達的基因。 2、用IPA軟件分析這些差異表達基因的功能及相互作用網絡。 3、收集育齡婦女不同時期子宮內膜,用Realtime PCR驗證這些差異表達基因在不同時期子宮內膜中的表達規(guī)律。 結果： 1、用生物信息學的方法整合已有的基因芯片數據,挖掘出子宮內膜容受窗期差異表達大于2倍的基因1543個,大于5倍的基因148個,大于10倍的基因31個。 2、基因功能分析發(fā)現差異基因聚集最多的兩個功能類是免疫反應和細胞周期。分子網絡分析發(fā)現高度差異表達的基因主要組成了兩個網絡,一個與心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能相關,另一個與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關,其中TGFB1, TNF, ERBB2和FSH, CTNNB1,ESR1分別處于兩個網絡的中心,具有關鍵調節(jié)作用。 3、我們選擇了9個基因(DKK1、S100P、FAM148A、MACA、SFRP4、CXCL14、 CRISP3、ANXA4和SFN)用Realtime PCR進行驗證,所有基因表達與生物信息學軟件挖掘的結果一致。 結論： 用生物信息學的方法從已有的數據庫中挖掘信息是一種可行的方法,不僅節(jié)約了資源,而且擴大了樣本量,可以得到更加可靠的信息。 第二部分s100P在子宮內膜容受性形成中的作用和機制研究 目的： 1、研究S100P在子宮內膜和胎盤中的時序表達規(guī)律。 2、觀察生殖激素對S100P表達的調節(jié)。 3、探討S100P對子宮內膜上皮細胞及基質細胞生理功能的影響。 4、研究S100P影響子宮內膜細胞生理變化的信號機制。 材料與方法： 1、收集育齡婦女不同時期子宮內膜和不同孕期婦女的胎盤組織,用Realtime PCR、Western blot和免疫熒光研究S100P的表達規(guī)律。并分離培養(yǎng)原代人子宮內膜上皮細胞和基質細胞,用細胞免疫熒光檢測S100P在細胞內的定位。 2、分離培養(yǎng)原代人子宮內膜基質細胞和上皮細胞,培養(yǎng)子宮內膜上皮細胞系RL952和Ishikawa,培養(yǎng)人胚胎滋養(yǎng)細胞系Bewo。加入不同濃度雌二醇(E2)、孕酮(P4)和HCG培養(yǎng),設空白對照,培養(yǎng)24-72h,用Realtime PCR和In-cell Western分析S100P表達的變化。 3、體外培養(yǎng)原代人子宮內膜基質細胞和上皮細胞系RL952,應用慢病毒系統(tǒng)建立S100P干擾和/或過表達的穩(wěn)轉細胞株,檢測S100P對細胞遷移和侵襲的影響。 4、建立Bewo細胞球體與RL952和基質細胞的共培養(yǎng)體系模擬體外胚胎植入模型,觀察S100P對胚胎與子宮內膜上皮細胞的粘附及胚胎滋養(yǎng)細胞在子宮內膜基質細胞中侵襲的影響。 5、鬼筆環(huán)肽染色觀察S100P對細胞骨架的影響；應用免疫熒光和Realtime PCR檢測S100P對β-catenin信號通路和NFkB信號通路分子的影響。 結果： 1、S100P在分泌中期子宮內膜中特異性高表達,較另外三個時期高100多倍,在子宮內膜腺上皮和基質中表達均增高。在妊娠期中,S100P在早孕絨毛和足月胎盤中高表達,而在早孕蛻膜和中孕胎盤中表達較低。細胞免疫熒光顯示S100P在胞漿和胞核中均有表達,其中以胞漿為主。 2、與對照組相比,孕激素、雌孕激素聯合和HCG可以上調原代人子宮內膜上皮細胞和基質細胞,及上皮細胞系Ishikawa中S100P的表達。在原代人子宮內膜基質細胞中,S100P對雌、孕激素和HCG的反應呈時間、劑量依賴性。 3、在基質細胞中過表達S100P后,S100PmRNA水平上調5倍以上,免疫熒光顯示蛋白表達水平也明顯上調。在RL952和Ishikawa細胞中干擾S100P,干擾效率達98%以上。在子宮內膜細胞中,S100P抑制了細胞的遷移,但促進了細胞侵襲。S100P促進了Bewo細胞球在基質細胞中的擴展。在RL952細胞中,S100P干擾后,Bewo細胞球與RL952的粘附能力減弱。 4、在子宮內膜上皮細胞中,S100P的表達變化與Ezrin的表達變化相反,干擾S100P促進了細胞骨架肌動蛋白在細胞膜的聚集。S100P抑制了子宮內膜基質細胞中β-catenin的核轉位,而促進了NFkB的核轉位,并且上調了NFkB信號通路的激活分子IKKB的表達。 結論： 1、S100P在子宮內膜容受窗期特異性高表達,參與了子宮內膜容受形成,可能在子宮內膜容受性的形成中起著重要作用。 2、在子宮內膜細胞中S100P的表達受到E、P和HCG的精確調控。 3、S100P影響子宮內膜細胞的遷移和侵襲,并且影響了胚胎在子宮內膜上皮細胞上的粘附和在基質細胞中的擴展。 4、S100P通過調節(jié)細胞骨架重構、調節(jié)β-catenin和NFkB信號通路活性,影響了子宮內膜細胞的運動與侵襲,進而調節(jié)胚胎在子宮內膜上的粘附與侵入。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R321

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