【摘要】：子宮內(nèi)膜接受胚胎著床的能力稱為子宮內(nèi)膜容受性。人類子宮內(nèi)膜只在月經(jīng)周期的20-24天具備接受胚胎植入的能力,稱為“子宮內(nèi)膜容受窗期”。在這一時(shí)期,子宮內(nèi)膜在下丘腦-垂體-卵巢軸的精確調(diào)控下發(fā)生了特殊的形態(tài)、生理和分子生物學(xué)的變化來易化胚胎植入。子宮內(nèi)膜容受性的建立是胚胎成功植入的決定因素,任何原因引起的子宮內(nèi)膜容受性不能建立或建立延遲,都會導(dǎo)致胚胎著床失敗。輔助生殖技術(shù)(ART)是解決人類不孕的重要手段,但試管嬰兒技術(shù)(IVF)發(fā)明至今其成功率仍在20-30%徘徊。人們認(rèn)為子宮內(nèi)膜容受性缺陷大約占導(dǎo)致著床失敗原因的2/3,而胚胎原因僅占1/3,無法診斷和治療子宮內(nèi)膜容受性異常也是ART成功的主要障礙。因此,容受性的診斷和評估對提高輔助生殖技術(shù)的成功率具有極其重要的臨床意義。尋找子宮內(nèi)膜容受窗期特異性表達(dá)的標(biāo)志分子,闡明子宮內(nèi)膜容受性形成的分子機(jī)制,將極大地推動生殖醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。 隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展,前期有許多研究應(yīng)用基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來尋找子宮內(nèi)膜容受性形成的標(biāo)志分子。然而,由于樣本量的限制、樣本來源的不同、數(shù)據(jù)本身的高維度及分析方法和分析標(biāo)準(zhǔn)的差異,這些高通量篩選得出的結(jié)果并不一致。目前,可靠的子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子仍然沒有找到,子宮內(nèi)膜容受性的分子機(jī)制仍不清楚。重復(fù)高通量篩選無疑是一件既費(fèi)錢又費(fèi)力的事,而前期大量高通量篩選堆積了大量數(shù)據(jù)并沒有得到充分利用。生物信息學(xué)的發(fā)展為我們有效利用前人的數(shù)據(jù)提供了平臺,不僅可以避免浪費(fèi),而且從一定程度上擴(kuò)大了樣本量,增加了數(shù)據(jù)的可靠性。本研究的第一部分應(yīng)用生物信息學(xué)的方法整合多中心數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,挖掘出在子宮內(nèi)膜容受窗期特異表達(dá)的分子作為標(biāo)志分子,并進(jìn)一步驗(yàn)證部分分子在著床窗口期的表達(dá)規(guī)律,為尋找容受性標(biāo)志分子及進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜容受形成的分子機(jī)制提供線索。 胚胎著床過程包括胚胎在子宮內(nèi)膜上定位、粘附與侵入等環(huán)節(jié),該過程涉及細(xì)胞的增生、凋亡、粘附、侵襲和血管增生等細(xì)胞學(xué)行為。S100P是本課題在前期生物信息學(xué)挖掘中發(fā)現(xiàn)的在容受窗期子宮內(nèi)膜特異性表達(dá)上調(diào)的分子。已知該分子廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,與腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、及血管生成有關(guān),然而該分子與子宮內(nèi)膜容受性形成的關(guān)系及在胚胎著床過程中的作用及機(jī)制目前還鮮有報(bào)道。本研究第二部分進(jìn)一步觀察S100P在子宮內(nèi)膜和胎盤中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律、P激素調(diào)節(jié),并用RNA干擾和過表達(dá)技術(shù)探討S100P在子宮內(nèi)膜容受性建立中的作用及可能機(jī)制。本研究將有助于我們更好的理解胚胎植入伊始子宮內(nèi)膜容受性建立的分子機(jī)制。 第一部分子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子的生物信息學(xué)挖掘與分析 目的： 1、從現(xiàn)有的基因芯片數(shù)據(jù)庫中挖掘子宮內(nèi)膜容受窗期特異表達(dá)的分子,為尋找子宮內(nèi)膜容受窗期標(biāo)志分子提供線索。 2、運(yùn)用功能分析及相互作用網(wǎng)絡(luò)分析方法,分析這些差異表達(dá)基因的功能及其相互作用網(wǎng)絡(luò),以進(jìn)一步了解子宮內(nèi)膜容受形成的分子機(jī)制。 3、收集臨床標(biāo)本驗(yàn)證生物信息學(xué)挖掘的結(jié)果。 材料與方法： 1、應(yīng)用生物信息學(xué)軟件GeneSifter從現(xiàn)有的基因芯片數(shù)據(jù)庫中挖掘篩選在子宮內(nèi)膜容受窗期特異性表達(dá)的基因。 2、用IPA軟件分析這些差異表達(dá)基因的功能及相互作用網(wǎng)絡(luò)。 3、收集育齡婦女不同時(shí)期子宮內(nèi)膜,用Realtime PCR驗(yàn)證這些差異表達(dá)基因在不同時(shí)期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)規(guī)律。 結(jié)果： 1、用生物信息學(xué)的方法整合已有的基因芯片數(shù)據(jù),挖掘出子宮內(nèi)膜容受窗期差異表達(dá)大于2倍的基因1543個(gè),大于5倍的基因148個(gè),大于10倍的基因31個(gè)。 2、基因功能分析發(fā)現(xiàn)差異基因聚集最多的兩個(gè)功能類是免疫反應(yīng)和細(xì)胞周期。分子網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)高度差異表達(dá)的基因主要組成了兩個(gè)網(wǎng)絡(luò),一個(gè)與心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能相關(guān),另一個(gè)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),其中TGFB1, TNF, ERBB2和FSH, CTNNB1,ESR1分別處于兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的中心,具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。 3、我們選擇了9個(gè)基因(DKK1、S100P、FAM148A、MACA、SFRP4、CXCL14、 CRISP3、ANXA4和SFN)用Realtime PCR進(jìn)行驗(yàn)證,所有基因表達(dá)與生物信息學(xué)軟件挖掘的結(jié)果一致。 結(jié)論： 用生物信息學(xué)的方法從已有的數(shù)據(jù)庫中挖掘信息是一種可行的方法,不僅節(jié)約了資源,而且擴(kuò)大了樣本量,可以得到更加可靠的信息。 第二部分s100P在子宮內(nèi)膜容受性形成中的作用和機(jī)制研究 目的： 1、研究S100P在子宮內(nèi)膜和胎盤中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律。 2、觀察生殖激素對S100P表達(dá)的調(diào)節(jié)。 3、探討S100P對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞生理功能的影響。 4、研究S100P影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生理變化的信號機(jī)制。 材料與方法： 1、收集育齡婦女不同時(shí)期子宮內(nèi)膜和不同孕期婦女的胎盤組織,用Realtime PCR、Western blot和免疫熒光研究S100P的表達(dá)規(guī)律。并分離培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞,用細(xì)胞免疫熒光檢測S100P在細(xì)胞內(nèi)的定位。 2、分離培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞,培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系RL952和Ishikawa,培養(yǎng)人胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞系Bewo。加入不同濃度雌二醇(E2)、孕酮(P4)和HCG培養(yǎng),設(shè)空白對照,培養(yǎng)24-72h,用Realtime PCR和In-cell Western分析S100P表達(dá)的變化。 3、體外培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞系RL952,應(yīng)用慢病毒系統(tǒng)建立S100P干擾和/或過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,檢測S100P對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。 4、建立Bewo細(xì)胞球體與RL952和基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)體系模擬體外胚胎植入模型,觀察S100P對胚胎與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的粘附及胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中侵襲的影響。 5、鬼筆環(huán)肽染色觀察S100P對細(xì)胞骨架的影響；應(yīng)用免疫熒光和Realtime PCR檢測S100P對β-catenin信號通路和NFkB信號通路分子的影響。 結(jié)果： 1、S100P在分泌中期子宮內(nèi)膜中特異性高表達(dá),較另外三個(gè)時(shí)期高100多倍,在子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)中表達(dá)均增高。在妊娠期中,S100P在早孕絨毛和足月胎盤中高表達(dá),而在早孕蛻膜和中孕胎盤中表達(dá)較低。細(xì)胞免疫熒光顯示S100P在胞漿和胞核中均有表達(dá),其中以胞漿為主。 2、與對照組相比,孕激素、雌孕激素聯(lián)合和HCG可以上調(diào)原代人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞,及上皮細(xì)胞系Ishikawa中S100P的表達(dá)。在原代人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中,S100P對雌、孕激素和HCG的反應(yīng)呈時(shí)間、劑量依賴性。 3、在基質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)S100P后,S100PmRNA水平上調(diào)5倍以上,免疫熒光顯示蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)。在RL952和Ishikawa細(xì)胞中干擾S100P,干擾效率達(dá)98%以上。在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中,S100P抑制了細(xì)胞的遷移,但促進(jìn)了細(xì)胞侵襲。S100P促進(jìn)了Bewo細(xì)胞球在基質(zhì)細(xì)胞中的擴(kuò)展。在RL952細(xì)胞中,S100P干擾后,Bewo細(xì)胞球與RL952的粘附能力減弱。 4、在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中,S100P的表達(dá)變化與Ezrin的表達(dá)變化相反,干擾S100P促進(jìn)了細(xì)胞骨架肌動蛋白在細(xì)胞膜的聚集。S100P抑制了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中β-catenin的核轉(zhuǎn)位,而促進(jìn)了NFkB的核轉(zhuǎn)位,并且上調(diào)了NFkB信號通路的激活分子IKKB的表達(dá)。 結(jié)論： 1、S100P在子宮內(nèi)膜容受窗期特異性高表達(dá),參與了子宮內(nèi)膜容受形成,可能在子宮內(nèi)膜容受性的形成中起著重要作用。 2、在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中S100P的表達(dá)受到E、P和HCG的精確調(diào)控。 3、S100P影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲,并且影響了胚胎在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上的粘附和在基質(zhì)細(xì)胞中的擴(kuò)展。 4、S100P通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)、調(diào)節(jié)β-catenin和NFkB信號通路活性,影響了子宮內(nèi)膜細(xì)胞的運(yùn)動與侵襲,進(jìn)而調(diào)節(jié)胚胎在子宮內(nèi)膜上的粘附與侵入。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R321
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本文編號：
2431454
