【摘要】：背景：激素性股骨頭缺血性壞死在臨床上較為常見,目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究表明,激素性股骨頭缺血性壞死與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力轉(zhuǎn)變、成骨細(xì)胞凋亡增加相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)是國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“早期激素性股骨頭缺血性壞死的蛋白質(zhì)組學(xué)動(dòng)態(tài)分析”的一部分,前部分實(shí)驗(yàn)顯示,早期激素性股骨頭缺血性壞死動(dòng)物模型股骨頭組織的骨細(xì)胞凋亡增加,膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào),由此推測膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力降低、成骨細(xì)胞凋亡增加。膜聯(lián)蛋白A1是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合多功能蛋白,參與細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡的調(diào)控。然而,目前有關(guān)膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)水平的改變與激素性股骨頭缺血性壞死發(fā)生之間的關(guān)系尚未明確,且未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。 本研究分三部分。 第一部分 兔膜聯(lián)蛋白A1基因短發(fā)夾RNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 目的：針對兔膜聯(lián)蛋白A1基因構(gòu)建短發(fā)夾RNA慢病毒載體,為后續(xù)觀察沉默膜聯(lián)蛋白Al對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞生物特性的影響,以及進(jìn)一步探討激素性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：針對兔膜聯(lián)蛋白Al基因設(shè)計(jì)RNA干擾靶序列,合成Oligo DNA,退火形成雙鏈DNA,與BamHI和EcoRI雙酶切后的pGLV/H1/GFP載體連接成pGLV-shANXA1, PCR篩選陽性克隆,測序鑒定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝產(chǎn)生慢病毒載體LV-shANXA1,并根據(jù)GFP的表達(dá)測定慢病毒的滴度。 結(jié)果：經(jīng)PCR和測序證實(shí)構(gòu)建片段大小及DNA序列與目標(biāo)序列一致,shANXA1片段完全正確插入慢病毒載體pGLV/H1/GFP中。包裝濃縮慢病毒顆粒LV-shANXA1-764、LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901LV-shANXA1-NC的滴度分別為3.7×108TU/L、4.1×108TU/L、3.6×108TU/L、3.7×108TU/L。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的兔膜聯(lián)蛋白A1基因短發(fā)夾RNA慢病毒載體。 第二部分沉默膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響 目的：觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1基因?qū)ν霉撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響。 方法：取新西蘭大白兔的全骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和純化,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度。用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的慢病毒載體LV、shANXA1-NC感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后測定細(xì)胞的感染效率,并篩選最佳的感染復(fù)數(shù)值。分別用慢病毒載體LV-shANXA1-764、 LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞下調(diào)ANXA1基因的表達(dá),采用Real time PCR不(?)Westem blot檢測慢病毒載體對ANXA1基因的沉默效率,并篩選最高沉默效率的慢病毒載體。 將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分三組：RNA干擾組用慢病毒載體LV-shANXA1-901感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1基因的表達(dá)；陰性對照組用攜帶無義基因序列的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；空白對照組不加任何干預(yù)措施。采用MTT法評估各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力；采用堿性磷酸酶染色、礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色和堿性磷酸酶活性的測定評估各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。 結(jié)果：純化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD44、CD105表達(dá)陽性率分別為97.2%和95.8%,而CD45陽性率為2.5%。LV-shANXA1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)的值為50。感染復(fù)數(shù)為50時(shí),LV-shANXA1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞感染效率為(91.4土2.7)%。實(shí)時(shí)PCR和Western blot檢測顯示,LV-shANXA1-901對膜聯(lián)蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染復(fù)數(shù)為50時(shí),沉默效率可達(dá)70%以上。膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)后,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)明顯生長抑制(P0.05),在隨后成骨分化誘導(dǎo)后,細(xì)胞的堿性磷酸酶染色陽性率和堿性磷酸酶活性明顯降低(P0.05),且茜素紅染色呈陰性反應(yīng)。 結(jié)論：慢病毒載體LV-shANXA1-901能有效沉默膜聯(lián)蛋白Al基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)；沉默膜聯(lián)蛋白A1基因降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化能力。 第三部分沉默膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)對兔成骨細(xì)胞凋亡的影響 目的：觀察沉默膜聯(lián)蛋白A1基因?qū)ν贸晒羌?xì)胞凋亡的影響。 方法：將體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞。用不同感染復(fù)數(shù)(MOI)值的慢病毒載體LV-shANXA1-N感染成骨細(xì)胞后測定細(xì)胞的感染效率,并篩選最佳的感染復(fù)數(shù)值。按最佳感染復(fù)數(shù)值的慢病毒載體LV-shANXA1-901感染成骨細(xì)胞下調(diào)ANXA1基因的表達(dá),采用Real timePCR(?)(?) Western blot檢測慢病毒載體對ANXA1基因的沉默效率。 將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞后分三組：RNA干擾組用攜帶針對膜聯(lián)蛋白A1基因的短發(fā)夾RNA慢病毒載體LV-shANXA1感染成骨細(xì)胞下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1基因的表達(dá)；陰性對照組用攜帶無義基因序列的慢病毒載體LV-shANXA1-NC感染陳骨細(xì)胞；空白對照組不加任何干預(yù)措施。采用半胱天冬酶3活性測定、流式細(xì)胞術(shù)及Tunel法評估ANXA1基因表達(dá)下調(diào)對成骨細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)14d后,細(xì)胞的堿性磷酸酶染色陽性率為(95.0±3.6)%,茜素紅染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。LV-shANXA1對成骨細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)的值為50。在感染復(fù)數(shù)為50時(shí),LV-shANXA1對成骨細(xì)胞感染效率為(92.6±3.7)%。Real-time PCR(?)(?)Western blot檢測顯示感染復(fù)數(shù)為50時(shí),LV-shANXA1對成骨細(xì)胞ANXA1基因的沉默效率效率可達(dá)70%以上。ANXA1表達(dá)下調(diào)后,成骨細(xì)胞半胱天冬酶3活性升高,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)(?)(?)Tunel法檢測細(xì)胞的凋亡率增加,均高于空白對照和陰性對照組(P0.05)。 結(jié)論：慢病毒載體LV-shANXA1-901能有效沉默膜聯(lián)蛋白A1基因在成骨細(xì)胞中的表達(dá)；沉默膜聯(lián)蛋白A1基因促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡；膜聯(lián)蛋白A1基因表達(dá)下調(diào)通過激活半胱天冬氨酸蛋白酶-3引起成骨細(xì)胞凋亡
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉愛鳳;膜聯(lián)蛋白A1對鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響[D];南華大學(xué);2013年

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本文編號：2431421