【摘要】：在胚胎發(fā)育的過程中,造血和內(nèi)皮細(xì)胞在發(fā)育時間和空間密切相關(guān)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為造血細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于一個共同前體,即血液血管干細(xì)胞;另一種觀點(diǎn)認(rèn)為造血細(xì)胞來源于功能成熟的內(nèi)皮細(xì)胞,即生血內(nèi)皮。關(guān)于造血細(xì)胞的起源是胚胎造血發(fā)育研究的難點(diǎn)。其原因是由于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell, HSC)難以明確定位,進(jìn)而無法揭示它的發(fā)育規(guī)律。作為造血組織的核心成分,HSC具有高度自我更新和在適當(dāng)條件下向多個方向分化為各系造血細(xì)胞的能力。一方面可以維持機(jī)體干細(xì)胞池的動態(tài)平衡和機(jī)體的正常造血,另一方面又使其自身變成一個多類型細(xì)胞的混合體。HSC不是單一的細(xì)胞群體,而是由不同等級的干細(xì)胞所組成,它們的表面抗原、免疫表型和黏附分子表達(dá)不一。因此,為了更好的研究HSC的起源和發(fā)育動力學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)和鑒定新的HSC特異性標(biāo)記顯的尤為重要。 基質(zhì)細(xì)胞OP9在研究造血和內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系以及鑒定血液血管干細(xì)胞分化功能中具有重要作用,因此我們首先對OP9的生物學(xué)性狀進(jìn)行了研究。從細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、多向分化能力、免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力、遷移能力對OP9進(jìn)行細(xì)胞學(xué)特性的鑒定。實驗證明,OP9呈成纖維細(xì)胞狀貼壁生長,具有成脂肪、成骨、成軟骨三系分化的潛能。該細(xì)胞系不表達(dá)造血和內(nèi)皮的標(biāo)記(CD34、CD31、CD11b、CD45、Flk1),不表達(dá)免疫共刺激分子CD86和MHCⅡ類分子,表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記CD44和CD29,表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記Sca-1,表達(dá)血管周細(xì)胞的標(biāo)記(CD140a、CD140b、α-SMA和Calponin)。某些因子如:bFGF、IGF-1、IL-3、PDGF-BB、TGF-β1和TGF-β3可以明顯促進(jìn)OP9細(xì)胞的遷移,而SDF-1α、BMP-2、BMP-4和VEGF的作用則較弱。OP9細(xì)胞能抑制有絲分裂原或異體淋巴細(xì)胞引起的T細(xì)胞增殖,具有免疫調(diào)節(jié)能力。上述數(shù)據(jù)表明OP9細(xì)胞具有MSCs典型特征,可用于今后在真正的干細(xì)胞水平研究MSCs。進(jìn)而,我們將OP9引進(jìn)血液和血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育分化研究中。我們對AGM區(qū)的細(xì)胞進(jìn)行免疫磁珠分選,將Tie2+細(xì)胞種在預(yù)先鋪有OP9的24孔板中,驗證OP9支持造血和支持內(nèi)皮生長的功能�；贠P9,我們建立了AGM區(qū)來源血液血管干細(xì)胞(即BL-CFC)的造血和內(nèi)皮分化功能的鑒定體系。在一定條件下,BL-CFC與OP9細(xì)胞共培養(yǎng),還可形成B淋巴細(xì)胞,證明BL-CFC具有定向造血的潛能。 為探索胚胎造血發(fā)育的特異性標(biāo)記,我們從多個造血前體類型(包括:髓系祖細(xì)胞、生血內(nèi)皮細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞前體、BL-CFC、HSC)入手,重點(diǎn)研究Flk-1和CD43的標(biāo)志意義。首先,我們分離E10.5、E11.5、E12.5各時間點(diǎn)AGM區(qū),用Ⅰ型膠原酶消化成單細(xì)胞懸液后,進(jìn)行磁珠分選,分別進(jìn)行計數(shù)。按照一定細(xì)胞數(shù)目接種于甲基纖維素半固體體系中,在細(xì)胞因子SCF、IL-6、IL-3、EPO存在的條件下,進(jìn)行CFU-C培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)Flk-1+細(xì)胞不能完全富集CFU-C,其形成髓系祖細(xì)胞的能力在E10.5最強(qiáng),之后趨于下降。相比,所有髓系祖細(xì)胞均表達(dá)CD43。 CFU-C反映了已經(jīng)定向的造血祖細(xì)胞的數(shù)量,而生血內(nèi)皮細(xì)胞的定量可通過OP9上造血簇的形成完成。結(jié)果表明:在細(xì)胞因子SCF、IL-3、FL、VEGF作用下,Flk-1+細(xì)胞在OP9細(xì)胞上形成造血細(xì)胞簇的效率高于Flk-1-細(xì)胞。Flk-1+細(xì)胞和Flk-1-細(xì)胞在OP9上生長7天后,非貼壁細(xì)胞均表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志CD45、Mac-1/Gr-1、B220、CD19等。Flk-1-細(xì)胞CD45、c-Kit表達(dá)比例均低于Flk-1+細(xì)胞,但Ter119比例較高。說明Flk-1-細(xì)胞形成的造血細(xì)胞簇分化形成紅細(xì)胞的能力更強(qiáng),而Flk-1+細(xì)胞c-Kit比例高,可能暗示其形成造血干祖細(xì)胞的能力更強(qiáng)。同樣,將貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫組化。發(fā)現(xiàn)Flk-1+細(xì)胞和Flk-1-細(xì)胞在OP9上生長7天后,貼壁細(xì)胞均表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志CD31、Endomucin,并且Flk-1+細(xì)胞可以在OP9上形成明顯的管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),Flk-1-細(xì)胞只能形成少量的管狀結(jié)構(gòu)。相比,僅CD43+細(xì)胞可形成造血細(xì)胞簇。CD43+細(xì)胞在OP9細(xì)胞上生長7天后,非貼壁細(xì)胞也表達(dá)髓系和淋系的表面標(biāo)志,但將貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫組化,發(fā)現(xiàn)CD43+群和CD43-群在OP9上的貼壁細(xì)胞均表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志CD31、Endomucin,提示CD43可區(qū)分生血和非生血內(nèi)皮細(xì)胞。 基于OP9細(xì)胞,我們研究了胚胎造血前體分子Flk-1和CD43分別與B淋巴細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在FL、IL-7等作用下,AGM區(qū)的Flk-1+細(xì)胞和Flk-1-細(xì)胞均有向B淋巴細(xì)胞分化的潛能。但只有CD43+細(xì)胞有向B淋巴細(xì)胞分化的潛能。之后,借助于甲基纖維素半固體體系,在細(xì)胞因子SCF、IL-6、IGF-1、VEGF、LIF、bFGF存在的條件下,我們研究了Flk-1和CD43在BL-CFC中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Flk-1+細(xì)胞形成BL-CFC的效率高于Flk-1-細(xì)胞。與Flk-1不同的是,BL-CFC僅集中在CD43+細(xì)胞生長,CD43-群細(xì)胞未見任何明顯集落生長。 最后,我們考察了Flk-1在HSC中的表達(dá)情況。常規(guī)分離不同時間點(diǎn)小鼠GFP+AGM區(qū)和胎肝細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,分選后,經(jīng)尾靜脈進(jìn)行移植。移植4個月后,采集受體外周血進(jìn)行流式細(xì)胞分析,以嵌合率≥10%為標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)E11.5、E12.5的AGM區(qū)和E12.5的FL中Flk-1+細(xì)胞和Flk-1-細(xì)胞均具有長期重建致死劑量照射小鼠造血系統(tǒng)的能力。為了進(jìn)一步分析其在體內(nèi)多系分化潛能,我們分別對受體外周血進(jìn)行了髓系標(biāo)志Mac-1/Gr1、B淋巴細(xì)胞標(biāo)志B220、T淋巴細(xì)胞標(biāo)志CD3檢測,均發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)比例的供體來源的髓系和淋系嵌合。此外,我們對對部分重建受體的胸腺、脾臟、骨髓進(jìn)行了檢測,均發(fā)現(xiàn)供體嵌合,表明Flk-1+細(xì)胞和Flk-1-細(xì)胞來源的造血細(xì)胞均具有向多系分化潛能。為了驗證HSC的自我更新能力,我們將已重建受體的骨髓進(jìn)行二次移植,移植兩個月后,發(fā)現(xiàn)受體重建,說明上述細(xì)胞能夠短期重建致死劑量照射小鼠造血系統(tǒng)。以上數(shù)據(jù)表明:AGM區(qū)來源的Flk-1+細(xì)胞和Flk-1-細(xì)胞均含有真正的HSC。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王躍春;張洹;;人胎骨髓MSCs的分離鑒定及其向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的分化[J];中國病理生理雜志;2007年11期

2 溫昱;李彬;黨瑞山;張傳森;張喜;劉艷春;;犬骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性及誘導(dǎo)分化(英文)[J];解剖學(xué)雜志;2008年03期

3 錢燕翔;舒群;蔡紅霞;郭娟;陳亮;高峰;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存復(fù)蘇后細(xì)胞表面標(biāo)志物分子學(xué)變化(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年01期

4 徐懷誠;;纖維光鏡用于標(biāo)志不明顯氣管的識別[J];國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志;1990年05期

5 段淵!100045北京,胡亞美!100045北京,潘凱楓!100045北京,周彤!100045北京,張聯(lián)!100045北京,呂有勇!100045北京;白血病患兒大劑量化療后不同階段免疫學(xué)狀態(tài)的變化[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2001年03期

6 文珠,石慶之,李潔,戎吉平,俞火;骨髓基質(zhì)培養(yǎng)上清作用下臍血造血細(xì)胞體外生長與表面標(biāo)志的關(guān)系[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年05期

7 李昊妍;梁景平;吳安平;張秀麗;殷德民;;體外培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年09期

8 柯金勇;林艷娟;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究[J];醫(yī)學(xué)綜述;2008年15期

9 郭琴琴 ,張忠聲;鼠胸腺樹突狀細(xì)胞的表面標(biāo)志分析[J];國際免疫學(xué)雜志;1992年04期

10 劉士先;邱香果;王玉俊;劉春霞;孫t，

本文編號：2431346