【摘要】：中藥注射劑是中藥的創(chuàng)新劑型,與傳統(tǒng)中藥比較具有生物利用度較高,起效迅速等特點(diǎn),能較好的發(fā)揮中藥治療急危重癥的特點(diǎn),尤其在心血管系統(tǒng)疾病、病毒性疾病和腫瘤的治療中具有不可替代的作用。但是隨著中藥注射液研發(fā)和生產(chǎn)的規(guī)模不斷擴(kuò)大以及在臨床的廣泛應(yīng)用,其安全性問(wèn)題逐漸暴露出來(lái)。目前我國(guó)的43個(gè)中成藥劑型中,注射劑這一種劑型引起的不良反應(yīng)就占了75%,這種情況已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。但是長(zhǎng)期以來(lái),由于對(duì)中藥注射液的不良反應(yīng)重視不夠,造成該方面的研究基礎(chǔ)極為薄弱。中藥注射液嚴(yán)重不良反應(yīng)中尤以過(guò)敏反應(yīng)的比例為最高,且反應(yīng)類型多為速發(fā)型變態(tài)反應(yīng),但目前國(guó)內(nèi)外均未建立針對(duì)中藥致敏原的敏感動(dòng)物模型和標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)方法,嚴(yán)重影響了中藥注射液的臨床前安全性評(píng)價(jià),使其在臨床上的應(yīng)用受到了很大的限制。 本研究以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液及其中的疑似致敏成分黃芩苷、綠原酸作為致敏原,以天花粉蛋白為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)觀察過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率、過(guò)敏反應(yīng)程度、組胺增長(zhǎng)率、靶器官病變率和病變程度,對(duì)BN大鼠和豚鼠在評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)中的適用性進(jìn)行比較,篩選出適合評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型；并通過(guò)全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)(ASA)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)(PCA)對(duì)該模型的特異性進(jìn)行研究；在此基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)致敏參數(shù)(致敏劑量、致敏次數(shù)、致敏途徑、致敏時(shí)間間隔)和激發(fā)參數(shù)(攻擊劑量、攻擊途徑、攻擊間隔、攻擊體積)的明確,建立一套適合評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的規(guī)范化研究方法；在建立的動(dòng)物模型上,以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、魚(yú)腥草注射液、穿琥寧注射液、燈盞花素注射液為受試樣本,以青霉素為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒、IgE抗體含量、血清中過(guò)敏介質(zhì)和Th1/Th2型細(xì)胞因子含量的研究,對(duì)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行探討。本研究獲得國(guó)家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃的資助。 1.BN大鼠和豚鼠對(duì)評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的適用性研究 本研究以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為致敏原,直接對(duì)BN大鼠和豚鼠進(jìn)行致敏,致敏途徑為腹腔注射、致敏劑量為人臨床的等倍劑量,致敏次數(shù)為3次,隔日1次,在末次致敏后的第14天進(jìn)行攻擊,攻擊途徑為一次性靜脈推注,攻擊體積為致敏體積的2倍。攻擊后觀察過(guò)敏反應(yīng)癥狀,根據(jù)SFDA的全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算過(guò)敏反應(yīng)率、過(guò)敏反應(yīng)程度；采用ELISA法檢測(cè)血清、肺組織和氣管中組胺含量并計(jì)算組胺增長(zhǎng)率;HE染色法光鏡下觀察肺組織和氣管病理改變并計(jì)算靶器官病變率和病變程度,以此為依據(jù)對(duì)BN大鼠和豚鼠在評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)中的適用性進(jìn)行比較。 結(jié)果顯示：以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為受試樣本,①BN大鼠各組的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率分別為55.56%、61.11%、75.00%和83.33%,而豚鼠各組的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率分別為22.22%、27.77%、16.67%和41.67%,BN大鼠對(duì)四種受試的中藥注射液及藥物成分的過(guò)敏率均明顯高于豚鼠,兩種動(dòng)物比較均具有顯著性差異。②四種受試樣本致BN大鼠的過(guò)敏程度均比豚鼠嚴(yán)重,其中雙黃連注射液組和黃岑苷組的BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)程度與豚鼠比較具有顯著性差異。③BN大鼠血清、肺組織和氣管中的組胺增長(zhǎng)率均明顯高于豚鼠,其中清開(kāi)靈注射液的血清、肺組織、氣管,雙黃連注射液的血清和肺組織,黃芩苷的血清,綠原酸的肺組織中的組胺增長(zhǎng)率與豚鼠比較均具有顯著性差異。④四種受試樣本BN大鼠各組的肺組織病變率分別為66.67%、72.22%、66.67%和41.67%,而豚鼠各組的肺部病變率分別為44.44%、44.44%、25.00%和8.33%,BN大鼠對(duì)四種受試樣本的肺組織病變率均明顯高于豚鼠,其中黃芩苷組的BN大鼠肺組織病變率與豚鼠比較具有顯著性差異。BN大鼠各組的氣管病變率與豚鼠各組比較沒(méi)有顯著性差異。⑤四種受試樣本致BN大鼠肺組織的病理改變程度均比豚鼠嚴(yán)重,其中雙黃連注射液組和黃芩苷組的BN大鼠肺組織病變程度與豚鼠比較具有顯著性差異；四種受試樣本致BN大鼠氣管的病理改變程度與豚鼠比較均沒(méi)有顯著性差異。 試驗(yàn)結(jié)果證明：在評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)中,BN大鼠的敏感性明顯高于豚鼠,說(shuō)明BN大鼠可能為評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的適宜動(dòng)物模型。 2.中藥注射液致BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)的特異性研究 2.1中藥注射液致BN大鼠的全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)(ASA) 本實(shí)驗(yàn)以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為受試樣本,以天花粉蛋白為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)觀察BN大鼠的過(guò)敏反應(yīng)癥狀,Elisa法檢測(cè)血清、肺組織和氣管中組胺含量的變化,HE染色法光鏡下觀察心臟、肝臟、脾臟、肺、氣管、胃和小腸的病理改變,并從中篩選出特異性的靶器官,來(lái)明確中藥注射液致BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)的特異性。 結(jié)果顯示：①BN大鼠對(duì)清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸均產(chǎn)生了特異性的過(guò)敏反應(yīng)的癥狀和表現(xiàn)。BN大鼠產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)癥狀主要包括躁動(dòng)、顫抖、搔鼻、噴嚏、呼吸急促等,多在攻擊后10-20min內(nèi)出現(xiàn),15min以內(nèi)緩解,嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)靜臥、肌張力下降、體表溫度下降、抽搐、暈厥等過(guò)敏性休克的癥狀,甚至出現(xiàn)死亡。②BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)模型的血清、肺組織和氣管中的組胺含量均明顯升高,與正常對(duì)照組比較均具有顯著性差異,說(shuō)明BN大鼠的過(guò)敏反應(yīng)均引起明顯的組胺釋放,組胺釋放到靶器官并釋放入血。③在過(guò)敏反應(yīng)的靶器官篩選中發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、胃、小腸均沒(méi)有出現(xiàn)明顯的病理改變,而各組BN大鼠的肺組織和氣管均出現(xiàn)了明顯的炎癥性病理改變,說(shuō)明肺和氣管為中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的主要靶器官。④陽(yáng)性藥對(duì)照組BN大鼠也出現(xiàn)了特異性的過(guò)敏反應(yīng)的癥狀,主要包括靜臥、排糞(大便稀溏)、呼吸困難、呼吸急促、步態(tài)不穩(wěn)、肌張力下降、反應(yīng)敏感度下降、喘息等癥狀,多在攻擊后10min內(nèi)出現(xiàn),30min-1h后緩解；血清、肺組織和氣管中均可見(jiàn)明顯的組胺釋放；在過(guò)敏反應(yīng)的靶器官篩選中發(fā)現(xiàn),BN大鼠肺組織和氣管中出現(xiàn)了明顯的炎癥性病理改變,據(jù)綜合判斷,肺和氣管為陽(yáng)性對(duì)照(天花粉蛋白)致BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)的主要靶器官。 試驗(yàn)結(jié)果證明：BN大鼠對(duì)以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸為代表的中藥注射液和藥物成分能產(chǎn)生特異性的全身速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。2.2中藥注射液致BN大鼠的被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)(PCA) 本實(shí)驗(yàn)以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、魚(yú)腥草注射液、穿琥寧注射液和燈盞花素注射液為受試樣本,以青霉素鈉為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)BN大鼠致敏后制備抗血清,以1:25和1:50兩個(gè)稀釋度的抗血清對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行致敏和激發(fā),通過(guò)觀察伊文思藍(lán)滲出和藍(lán)斑反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)BN大鼠在中藥注射液致皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)中的特異性。 結(jié)果顯示,1:25和1:50稀釋度的抗血清各組均出現(xiàn)了明顯的伊文思藍(lán)滲出,對(duì)于多數(shù)中藥注射液,1:25稀釋度組的伊文思藍(lán)吸光度高于1:50稀釋度組,說(shuō)明1:25稀釋度抗血清中IgE抗體的含量較高。1:25稀釋度的抗血清攻擊后,各藥物組均有動(dòng)物出現(xiàn)了藍(lán)斑反應(yīng),藍(lán)斑直徑大于5mm,其中雙黃連注射液小劑量組、魚(yú)腥草注射液小劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組均有3只動(dòng)物出現(xiàn)了藍(lán)斑,反應(yīng)陽(yáng)性率為75%,與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異；而1:50稀釋度的抗血清攻擊后,只有雙黃連注射液小劑量組和陽(yáng)性藥對(duì)照組出現(xiàn)了藍(lán)斑反應(yīng),反應(yīng)陽(yáng)性率分別為25%和50%。 試驗(yàn)結(jié)果證明：清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、魚(yú)腥草注射液、穿琥寧注射液、燈盞花素注射液均能通過(guò)BN大鼠制備的抗血清,使Balb/c小鼠產(chǎn)生明顯的皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng),證明BN大鼠為研究中藥注射液皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)的適宜動(dòng)物模型。 3.中藥注射液致BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型的規(guī)范化研究 本研究以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸作為受試樣本,以豚鼠作為對(duì)照,采用不同的致敏參數(shù)和激發(fā)參數(shù)：致敏劑量(人臨床等倍劑量、人臨床2倍劑量)、致敏途徑(ip、iv),攻擊次數(shù)(1次、2次)、攻擊時(shí)間間隔(末次致敏后的第14天和第21天)來(lái)進(jìn)行全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn),通過(guò)不同參數(shù)下對(duì)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率,組胺含量,肺組織、氣管的病變率和病變程度的比較,來(lái)明確適用于BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型的規(guī)范化條件。 結(jié)果顯示：①第1次攻擊BN大鼠各組均出現(xiàn)了過(guò)敏反應(yīng),其過(guò)敏反應(yīng)率基本上都高于第2次攻擊,因而確定攻擊的次數(shù)為1次,攻擊的時(shí)間間隔應(yīng)為末次致敏后的第14d。②iv小劑量組(致敏途徑為靜脈注射、致敏劑量為人臨床等倍劑量)對(duì)各受試樣本均產(chǎn)生了過(guò)敏反應(yīng),對(duì)清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率分別為50%、66.67%、75%和75%；iv小劑量組血清和組織中的組胺含量均明顯升高；iv小劑量組BN大鼠對(duì)清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、黃芩苷和綠原酸的肺組織病變率分別為50%、50%、75%和25%,與同組的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率具有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系,因此確定致敏途徑為靜脈注射、致敏劑量為臨床人的等倍劑量,而相應(yīng)的攻擊劑量為臨床人的2倍劑量。③在相同的致敏和攻擊條件下,BN大鼠組的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率、組胺釋放、肺組織、氣管的病變率和病變程度基本上都高于豚鼠組,說(shuō)明在同等條件下,BN大鼠對(duì)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的敏感性優(yōu)于豚鼠,重復(fù)性驗(yàn)證了前面的試驗(yàn)結(jié)果。 試驗(yàn)結(jié)果證明：以BN大鼠為動(dòng)物模型評(píng)價(jià)中藥注射液的過(guò)敏反應(yīng),其致敏和攻擊條件應(yīng)規(guī)范化為：致敏劑量為人臨床等倍劑量、致敏間隔為1日、致敏途徑為靜脈注射,攻擊劑量為致敏劑量的2倍、攻擊途徑為靜脈一次性注射、攻擊次數(shù)為1次、攻擊時(shí)間間隔為末次致敏后的第14天,這種方法在動(dòng)物數(shù)量較少的情況下也較為適用。 4.中藥注射液對(duì)BN大鼠過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制的研究 本研究以清開(kāi)靈注射液、雙黃連注射液、魚(yú)腥草注射液、穿琥寧注射液和燈盞花素注射液為受試樣本,以青霉素為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)BN大鼠進(jìn)行致敏和激發(fā),通過(guò)觀察BN大鼠的過(guò)敏反應(yīng)率、肺和氣管的病變率來(lái)評(píng)價(jià)中藥注射液致BN大鼠的過(guò)敏反應(yīng)情況,通過(guò)觀察腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒,血清中IgE抗體、過(guò)敏介質(zhì)和細(xì)胞因子含量的變化,來(lái)揭示中藥注射液的致敏反應(yīng)機(jī)制。 結(jié)果顯示：①各注射液組的BN大鼠均出現(xiàn)了明顯的過(guò)敏反應(yīng)癥狀,小劑量組過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率均高于大劑量組,與對(duì)照組比較具有顯著性差異；各注射液組的肺組織和氣管均出現(xiàn)了明顯的炎癥性病理改變。②各注射液組肥大細(xì)胞陽(yáng)性率均明顯升高,其中清開(kāi)靈注射液組、魚(yú)腥草注射液組、穿琥寧注射液組與對(duì)照組比較具有顯著性差異；陽(yáng)性對(duì)照藥青霉素組的肥大細(xì)胞陽(yáng)性率明顯升高,與對(duì)照組比較具有顯著性差異,且其陽(yáng)性率高于中藥注射液各組。③中藥注射液誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)后,BN大鼠血清中IgE抗體含量明顯升高,與對(duì)照組比較具有顯著性差異。④中藥注射液誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)后,BN大鼠血清中組胺、5-羥色胺、前列腺素D2和白三烯B4的含量均明顯升高,細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的含量均明顯升高,大部分組的IFN-γ/IL-4比值出現(xiàn)了降低的趨勢(shì)。 試驗(yàn)結(jié)果證明：在BN大鼠動(dòng)物模型上,中藥注射液可引起IgE抗體介導(dǎo)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng),其過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制可能與以下環(huán)節(jié)相關(guān)：①促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒后,釋放組胺、5-羥色胺、前列腺素D2和白三烯B4等過(guò)敏介質(zhì)；②誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子向Th2偏移,從而促進(jìn)IgE抗體合成。 綜上所述,我們得出以下研究結(jié)論： ●與豚鼠比較,BN大鼠可能為評(píng)價(jià)中藥注射液過(guò)敏反應(yīng)的適宜動(dòng)物模型； ●在BN大鼠動(dòng)物模型上,能產(chǎn)生特異性的全身主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)和皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)； ●采用BN大鼠模型對(duì)中藥致敏原進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí),其規(guī)范化參數(shù)為：致敏劑量為人臨床等倍劑量、致敏次數(shù)為3次、致敏間隔為1日、致敏途徑為靜脈注射,攻擊劑量為致敏劑量的2倍、攻擊途徑為靜脈注射、攻擊次數(shù)為1次、攻擊時(shí)間間隔為末次致敏后的第14天； ●在BN大鼠動(dòng)物模型上,中藥注射液可引起IgE抗體介導(dǎo)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng),其過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制可能與以下環(huán)節(jié)相關(guān)：①促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒后,釋放組胺、5-羥色胺、前列腺素D2和白三烯B4等過(guò)敏介質(zhì)；②誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子向Th2偏移,從而促進(jìn)IgE抗體合成。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R286;R-332

【引證文獻(xiàn)】

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1 戴學(xué)棟;曾繁光;方超;戴曉莉;馬玉奎;;中藥注射劑非臨床安全性評(píng)價(jià)的幾點(diǎn)考慮[J];中國(guó)藥師;2013年07期

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本文編號(hào)：2428905