【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在肝細胞內(nèi)復制過程中,病毒反轉錄酶(P蛋白)與前基因組RNA(Pregenomic RNA,pgRNA)上的RNA包裝信號ε形成P-ε復合物,啟動反轉錄合成和核衣殼裝配。封閉P-ε相互作用是一種極具吸引力的抗HBV策略。已知P-ε形成RNP復合物正常發(fā)揮活性時,需要熱休克蛋白(Heat-shock proteins,Hsps)參與。本研究探索Hsps抑制劑KNK437對HBV復制及轉錄的影響。主要運用了三種工作模型:HepG2.2.15細胞系、瞬時轉染1.05×HBV(pCH9-3091)質(zhì)粒的Huh7細胞系和瞬時轉染1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)質(zhì)粒的Huh7細胞系。采用CCK-8方法檢測KNK437的細胞毒性,ELISA測定細胞培養(yǎng)液上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平;q-PCR和qRT-PCR分別檢測細胞內(nèi)HBV核衣殼中DNA和細胞內(nèi)HBV RNA水平;Western blotting檢測細胞內(nèi)衣殼亞單位(core)表達水平;qRT-PCR檢測細胞內(nèi)Hsps本身的轉錄水平。結果表明:20μM KNK437對細胞沒有毒性,且在該濃度下KNK437除HepG2.2.15模型外,均下調(diào)HBV HBsAg和HBeAg的胞外分泌,抑制細胞內(nèi)HBV核衣殼中DNA合成,降低細胞內(nèi)HBV RNA轉錄水平,最低可使DNA水平降至1.5%左右,RNA水平降至30%左右,從而表明KNK437抑制HBV復制和轉錄。在HepG2.2.15中的Western blotting顯示,KNK437明顯減少細胞內(nèi)衣殼亞單位(core)表達水平。KNK437也抑制Hsp70,Hsp90b,Hsp40等三種熱休克蛋白RNA的轉錄,從而驗證了它的確是一種泛Hsps抑制劑。本研究結果顯示KNK437具有潛在抗HBV應用前景。
[Abstract]:During the replication of hepatitis B virus (Hepatitis B virus,HBV) in hepatocytes, the retrovirus reverse transcriptase (P protein) formed P- 蔚 complex with the RNA packaging signal 蔚 on the pregenomic RNA (Pregenomic RNA,pgRNA. Initiating reverse transcription synthesis and core-capping assembly. Closed P- 蔚 interaction is an attractive anti-HBV strategy. It is known that heat shock protein (Heat-shock proteins,Hsps) is involved in P- 蔚 forming RNP complex. The aim of this study was to investigate the effects of Hsps inhibitor KNK437 on HBV replication and transcription. Three working models were used: HepG2.2.15 cell line, Huh7 cell line with 1. 05 脳 HBV (pCH9-3091) plasmid and Huh7 cell line with 1. 3 脳 HBV (pGEM-1.3 脳 HBV) plasmid. The cytotoxicity of KNK437 was detected by CCK-8, the levels of HBsAg and HBeAg in the supernatant of cell culture medium were measured by ELISA, DNA and HBV RNA in the core-shell of HBV were detected by q-PCR and qRT-PCR, respectively. Western blotting was used to detect the expression of (core) and qRT-PCR was used to detect the transcriptional level of Hsps itself. The results showed that 20 渭 M KNK437 was not toxic to cells, and at this concentration, KNK437 could down-regulate the extracellular secretion of HBV HBsAg and HBeAg, inhibit the synthesis of DNA in HBV nucleocapsid and decrease the level of HBV RNA transcription. The lowest level of KNK437 can reduce the DNA level to about 1.5% and the RNA level to about 30%, which indicates that KNK437 inhibits HBV replication and transcription. Western blotting in HepG2.2.15 showed that KNK437 significantly reduced the (core) expression level of cell underwear shell subunit. KNK437 also inhibited the transcription of three heat shock proteins (Hsp70,Hsp90b,Hsp40) RNA, which proved that it was indeed a pan-Hsps inhibitor. The results of this study indicate that KNK437 has a potential application prospect of anti-HBV.
【作者單位】： 湖北工業(yè)大學生物醫(yī)藥研究院中德生物醫(yī)學中心;中國科學院武漢病毒研究所病毒學國家重點實驗室;
【基金】：湖北省自然科學基金重點項目(項目號:2014CFA075);題目:RNA誘餌分子抗HBV功效的體內(nèi)研究 武漢市科技局應用基礎研究計劃(項目號:2015060101010033);題目:肝癌早期診斷與靶向藥物設計
【分類號】：R373.21

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本文編號：2428532