【摘要】：目的:探討谷氨酸信號通路在表皮中的作用機制。 方法: 1.原代培養(yǎng)并純化黑素細胞(Melanocyte,MC);倒置顯微鏡觀察MC細胞形態(tài);免疫熒光顯微鏡觀察MC中離子型谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸受體1(NMDAR1)和N-甲基-D-天冬氨酸受體2A(NMDAR2A)的細胞內分布;共聚焦顯微鏡觀察谷氨酸信號通路對MC胞內鈣離子濃度的影響以及MC內β-tubulin的分布。 2.原代培養(yǎng)并純化角質形成細胞(Keratinocyte,KC);倒置顯微鏡觀察KC細胞形態(tài);免疫熒光顯微鏡觀察KC中NMDAR1和NMDAR2A的細胞內分布;共聚焦顯微鏡觀察谷氨酸信號通路對KC胞內鈣離子濃度的影響以及KC內β-tubulin的分布;流式細胞儀測定NMDA受體拮抗劑MK-801對KC凋亡的作用。 3.建立MC和KC共培養(yǎng)體系;倒置顯微鏡觀察二者共培養(yǎng)的形態(tài);掃描電鏡觀察MK-801作用下二者相互作用的形態(tài)學改變;酶標儀測定由MC向KC轉運的黑素顆粒OD475值。 結果: 1.倒置顯微鏡下MC呈樹突樣生長;免疫熒光顯微鏡下顯示黑素細胞中的NMDAR1和NMDAR2A均主要分布在細胞漿內,而NMDA2A在樹突分叉處表達更多;100μM濃度的NMDA使黑素細胞瞬時鈣離子濃度升高,100μM濃度MK-801使其瞬時鈣離子濃度降低,MK-801事先作用于MC5min或1h阻斷了NMDA受體后,NMDA均不能再次誘發(fā)瞬時鈣離子濃度升高;共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)MK-801作用24小時后導致黑素細胞樹突回縮,胞內β-tubulin重新分布聚集于核周。 2.倒置顯微鏡下KC為鋪路石樣生長;免疫熒光顯微鏡下顯示角質細胞中的NMDAR1和NMDAR2A均主要分布在細胞漿內;100μM濃度的NMDA使角質細胞瞬時鈣離子濃度升高;流式細胞儀顯示100μM的MK-801孵育角質細胞48h后凋亡細胞比例較對照組無明顯差異;共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)MK-801作用24小時后導致角質細胞核周的β-tubulin密度增大。 3.掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)100μM MK-801作用于共培養(yǎng)體系48h后,MC樹突數(shù)量無明顯變化,KC之間相互連接的絲狀偽足的數(shù)量、KC表面的絲狀偽足數(shù)量以及MC-KC間的絲狀偽足減少;通過酶標儀測定共培養(yǎng)48h后,使用100μM MK-801孵育組與正常共培養(yǎng)的未處理組相比較,KC中的黑素顆粒OD475值明顯降低,提示從MC向KC轉運的黑素小體數(shù)量減少。 結論: 1.MC內有NMDAR1及NMDAR2A的表達。 2.谷氨酸信號通路可影響MC胞內鈣離子濃度。 3.谷氨酸信號通路通過作用于MC內β-tubulin而影響MC絲狀偽足的數(shù)量,而后者是該通路影響MC和KC間黑素轉運的結構基礎。 4.KC內有NMDAR1及NMDAR2A的表達。 5.谷氨酸信號通路影響KC細胞形態(tài)及其胞內鈣離子濃度,而該形態(tài)學改變與細胞凋亡無關;同時影響KC中β-tubulin分布。
[Abstract]:Objective: to investigate the mechanism of glutamate signaling pathway in epidermis. Methods: 1. Melanocytes (Melanocyte,MC) were cultured and purified, and the morphology of MC cells was observed by inverted microscope. The intracellular distribution of N-methyl-D-aspartate receptor 1 (NMDAR1) and N-methyl-D-aspartate receptor 2A (NMDAR2A) in MC were observed by immunofluorescence microscopy. The effect of glutamate signal pathway on intracellular calcium concentration of MC and the distribution of 尾-tubulin in MC were observed by confocal microscope. 2. Primary culture and purification of keratinocytes (Keratinocyte,KC), observation of morphology of KC cells by inverted microscope, observation of intracellular distribution of NMDAR1 and NMDAR2A in KC by immunofluorescence microscopy; The effect of glutamate signaling pathway on intracellular calcium concentration of KC and the distribution of 尾-tubulin in KC were observed by confocal microscopy, and the effect of MK-801, a NMDA receptor antagonist, on KC apoptosis was determined by flow cytometry. 3. The co-culture system of MC and KC was established, the morphology of coculture was observed by inverted microscope, the morphological changes of the interaction between the two were observed by scanning electron microscope, and the OD475 value of melanin particles transported from MC to KC was measured by enzyme labeling. Results: 1. NMDAR1 and NMDAR2A in melanocytes were mainly distributed in cytoplasm and NMDA2A was expressed more in dendritic bifurcation under inverted microscope. 100 渭 M concentration of NMDA increased the instantaneous calcium concentration of melanocytes, and 100 渭 M concentration of MK-801 decreased the instantaneous calcium concentration of melanocytes. NMDA could not induce the transient calcium concentration of melanocytes to increase again after blocking the NMDA receptor by MK-801 for 1 h or before MC5min. Confocal microscopy showed that after 24 hours of MK-801 treatment, melanocyte dendrites retracted and 尾-tubulin was redistributed and gathered around the nucleus. 2. The NMDAR1 and NMDAR2A in keratinocytes were mainly distributed in cytoplasm by immunofluorescence microscope, and the instantaneous calcium concentration of keratinocytes was increased by 100 渭 M NMDA. Flow cytometry showed that there was no significant difference in the percentage of apoptotic cells in keratinocytes incubated with 100 渭 M MK-801 for 48 h, and the density of 尾-tubulin in keratinocytes was increased after 24 hours of MK-801 exposure under confocal microscope. 3. SEM observation showed that the number of MC dendrites did not change significantly after treated with 100 渭 M MK-801 for 48 h, but the number of KC interlinked pseudopodia, the number of KC surface filamentous pseudopodia and the number of MC-KC were decreased. After 48 hours of co-culture, compared with the untreated group cultured with 100 渭 M MK-801, the OD475 value of melanin particles in KC decreased significantly, suggesting that the number of melanosomes transported from MC to KC was decreased. Conclusion: NMDAR1 and NMDAR2A are expressed in 1.MC. 2. Glutamate signaling pathway can affect the intracellular calcium concentration of MC. 3. Glutamate signaling pathway affects the number of MC filamentous pseudopodia by acting on 尾-tubulin in MC, which is the structural basis of the pathway affecting the transport of melanin between MC and KC. NMDAR1 and NMDAR2A were expressed in 4.KC. 5. Glutamate signaling pathway affects the morphology and intracellular calcium concentration of KC cells, but the morphological changes are not related to apoptosis and the distribution of 尾-tubulin in KC.
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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