【摘要】：在瘧疾流行地區(qū),孕婦是感染瘧疾的高危人群。在撒哈拉以南非洲地區(qū),每年有二千五百萬(wàn)孕婦受到瘧疾感染的威脅,妊娠相關(guān)瘧疾(Pregnancy associated malaria,PAM)已經(jīng)成為疫源地最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。PAM會(huì)導(dǎo)致新生兒低體重(Low birth weight,LBW)、流產(chǎn)、母體貧血。在全球范圍內(nèi),這一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥每年造成大約75,000—200,000例嬰兒死亡。妊娠期間被蟲(chóng)體感染紅細(xì)胞(Parasitized red blood cells,PRBC)在胎盤(pán)的大量聚集是導(dǎo)致該病發(fā)病的主要原因。這一聚集現(xiàn)象是由一種獨(dú)特的惡性瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞表面抗原1(Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1,PfEMP1)與胎盤(pán)受體(Chondroitin sulfate A ,CSA)的粘附介導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn),這一獨(dú)特的PfEMP1蛋白的編碼基因是var2csa,屬于var基因家族成員。VAR2CSA是一個(gè)350kDa的高分子量蛋白質(zhì)包含有六個(gè)DBL區(qū)。高水平的抗VAR2CSA抗體與PAM的保護(hù)性免疫有關(guān)。至此,基于VAR2CSA用于疫苗的研究,來(lái)保護(hù)瘧疾流行地區(qū)的孕婦是可行的。但在目前的技術(shù)條件下表達(dá)如此之大的一個(gè)蛋白質(zhì)是十分困難的。因此,十分有必要鑒定出哪一個(gè)DBL區(qū)在粘附過(guò)程中發(fā)揮主要作用?以及人體對(duì)哪一個(gè)功能區(qū)的免疫應(yīng)答反應(yīng)在抗病免疫上起到關(guān)鍵作用?本實(shí)驗(yàn)就上述存在的問(wèn)題進(jìn)行研究,克隆、表達(dá)了六個(gè)DBL區(qū)重組蛋白質(zhì),利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),將得到的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)和免疫識(shí)別實(shí)驗(yàn),對(duì)不同DBL區(qū)同CSA的親和能力差異與免疫差異進(jìn)行了研究。 根據(jù)不同DBL區(qū)的序列設(shè)計(jì)6對(duì)引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)海南株基因組DNA中的六個(gè)目的片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接。經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定正確后克隆至表達(dá)載體pET-22b上,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21 ( DE3 ),以異丙基β-D-硫代半乳糖苷( Isopropyithionβ-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,并用親和層析方法純化蛋白。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulf polyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)目的蛋白。結(jié)果顯示不同組氨酸標(biāo)簽DBL區(qū)重組蛋白質(zhì)分子質(zhì)量與理論值相符。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示目的蛋白質(zhì)具有反應(yīng)原性。 利用ELISA方法對(duì)六個(gè)重組蛋白質(zhì)與CSA的粘附能力進(jìn)行檢測(cè)。用CSA包被ELISA板,四度過(guò)夜。將板洗滌三次后,加入3%的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)進(jìn)行封閉,37℃孵育1h。此后洗板三次,加入梯度稀釋的重組蛋白質(zhì)并在37℃孵育1h。洗板三次,加入5000倍稀釋的鼠抗組氨酸標(biāo)簽抗體,37℃孵育1h。洗滌三次,加入20000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體,37℃孵育1h。洗滌三次,加入顯色劑顯色30分鐘,最后測(cè)定OD405值。結(jié)果顯示在任何濃度條件下,DBL5區(qū)的OD405都高于其他重組蛋白質(zhì),并且達(dá)到陰性對(duì)照的Sj23的2.1倍。且所有DBL區(qū)重組蛋白質(zhì)的OD405均高于Sj23。這表明,盡管所有DBL區(qū)都能與CSA發(fā)生粘附,但DBL5區(qū)與CSA的粘附能力更強(qiáng)。 運(yùn)用ELISA方法進(jìn)行不同DBL區(qū)的免疫識(shí)別實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法與粘附實(shí)驗(yàn)大致相同,但是包被物為重組蛋白質(zhì),且用妊娠相關(guān)瘧疾病人血清和抗人IgG抗體替換了上述實(shí)驗(yàn)的重組蛋白和羊抗鼠抗體,并且沒(méi)有加入抗組氨酸標(biāo)簽抗體。結(jié)果經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同DBL區(qū)重組蛋白質(zhì)間P=0.000,P0.01,不同DBL區(qū)重組蛋白質(zhì)對(duì)PAM病人血清中抗體識(shí)別的差異影響具有顯著意義。其中以DBL5區(qū)OD405均值最高,Sj23 OD405均值最低。這表明在PAM抗病免疫過(guò)程中,人體對(duì)DBL5區(qū)的免疫應(yīng)答可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 這一研究結(jié)果不僅對(duì)基于VAR2CSA的PAM疫苗研發(fā)奠定了重要理論基礎(chǔ),而且對(duì)于其他基于PfEMP1蛋白質(zhì)家族的疫苗研發(fā)也具有一定意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R382.31

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9 陳f，

本文編號(hào)：2426306