【摘要】：研究背景 干細(xì)胞是指在一定條件下具有無限制自我更新和增殖分化能力的一類細(xì)胞。按其存在的不同時期可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞是存在于各種已分化組織中的未分化細(xì)胞。目前已經(jīng)在多種組織中發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞的存在,如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等。子宮內(nèi)膜是一個高度活躍的組織,具有很強的自我更新及修復(fù)能力,月經(jīng)、分娩、絕經(jīng)后激素補充治療等都能從內(nèi)膜基底層再生出腺體和基質(zhì),形成新的功能層。早在1978年P(guān)rianishnikov因子宮內(nèi)膜具有周期性增殖、分化和脫落的特點而提出存在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的可能,又指出干細(xì)胞可能存在于子宮內(nèi)膜基底層,即在子宮肌層與內(nèi)膜交界區(qū),從而使功能層內(nèi)膜增生修復(fù),始而往復(fù)。隨后有作者在臨床實踐中又發(fā)現(xiàn),在為功能失調(diào)性子宮出血的婦女電切大部分子宮內(nèi)膜后,內(nèi)膜還可部分再生,并有妊娠的報道,證明了存在干細(xì)胞再生子宮內(nèi)膜的可能。 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞是一群具有無限增殖能力的細(xì)胞,通過單克隆細(xì)胞培養(yǎng)可以從功能上鑒定。單克隆細(xì)胞培養(yǎng)主要有軟瓊脂培養(yǎng)法、有限稀釋法、單細(xì)胞顯微操作法和流式細(xì)胞儀分離法等多種方法,其中有限稀釋法最常用。其原理是將細(xì)胞懸液連續(xù)倍數(shù)稀釋至極低密度,然后接種于培養(yǎng)板上,培養(yǎng)一段時間后可能出現(xiàn)單個細(xì)胞克隆。它與軟瓊脂培養(yǎng)法、單細(xì)胞顯微操作法和流式細(xì)胞儀分離法等方法比較,具有操作簡單,周期較短和費用較低的優(yōu)點。 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞為分化未成熟的細(xì)胞,不能僅從形態(tài)學(xué)上將子宮內(nèi)膜干細(xì)胞與其他子宮內(nèi)膜細(xì)胞加以區(qū)別,一般多從功能上界定。當(dāng)然,最好的方法是利用特異識別的組織學(xué)和免疫學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行判定干細(xì)胞。目前尚未發(fā)現(xiàn)其特異性標(biāo)志物,但有較多文獻(xiàn)報道可能的候選標(biāo)志物有：CD90、CD29、CD73,可能不表達(dá)的標(biāo)志物有：CD133、CD34、CD45。 乙醛脫氫酶(ALDH)是細(xì)胞內(nèi)的一組同工酶,在干細(xì)胞分化早期使視黃醇氧化成視黃酸,ALDH1是ALDH家族的主要成員。ALDEFLUOR檢測試劑盒提供的不帶電荷的ALDH底物(BAAA)能夠通過擴散進(jìn)入活細(xì)胞。被細(xì)胞內(nèi)的ALDH轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的反應(yīng)產(chǎn)物(BAA-)。該產(chǎn)物滯留在具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞中,使ALDH高表達(dá)的細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的熒光(ALDHhigh),可以通過流式細(xì)胞儀的綠色通道檢出。在乳腺組織的正常細(xì)胞或癌細(xì)胞中,ALDEFLOUR陽性細(xì)胞具有類似干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力,而陰性細(xì)胞則無此功能。在造血細(xì)胞、胰腺癌和肺癌等多種組織中ALDH1高表達(dá),故ALDH1有望成為分離和鑒別多種干細(xì)胞的共同標(biāo)志。 干細(xì)胞分化的機理和誘導(dǎo)條件迄今為止還不清楚,大多數(shù)人認(rèn)為干細(xì)胞的分化與其所處的微環(huán)境“壁龕”密切相關(guān),不同的組織細(xì)胞微環(huán)境有著不同的細(xì)胞因子,可能是誘導(dǎo)干細(xì)胞獲得靶組織的表型,并向不同細(xì)胞譜系分化的主要原因之一。已有研究證實,視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞與視細(xì)胞分化。還有研究采用毛囊培養(yǎng)上清液模擬體內(nèi)的微環(huán)境,發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向毛囊干細(xì)胞分化的潛能。 因子宮內(nèi)膜干細(xì)胞本身的生物學(xué)特性以及方便的取材,使它在組織替代治療等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。有試驗發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞促進(jìn)血管生成治療燒傷,另有科學(xué)家在帕金森模型的小鼠體內(nèi)注入子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可以生成多巴胺治療帕金森病。子宮內(nèi)膜是胚胎發(fā)育的溫床,子宮內(nèi)膜過薄可阻礙受精卵在子宮內(nèi)膜著床和發(fā)育,子宮內(nèi)膜創(chuàng)傷或感染是導(dǎo)致婦女宮腔粘連和不孕的常見原因之一,其治療策略最重要的一點是促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生和功能恢復(fù),而對于重度或廣泛的內(nèi)膜損傷,目前的治療方法尚難以解決子宮內(nèi)膜重新再生問題。另外,子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的數(shù)量、功能、調(diào)控和定位機制的改變也可以引發(fā)各種子宮內(nèi)膜疾病,近年來干細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療的研究越來越多。通過對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的研究,可進(jìn)一步了解、認(rèn)識子宮內(nèi)膜的發(fā)生、增殖和演變規(guī)律,為子宮內(nèi)膜增殖異常的疾病、子宮內(nèi)膜的損傷、受孕和胚胎植入、絕經(jīng)后的激素補充治療以及腫瘤等多種疾病的預(yù)防和治療,提供了一種新的理念和重要的指導(dǎo)意義。 本課題擬于體外分離、培養(yǎng)、鑒定子宮內(nèi)膜干細(xì)胞,并對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化,以證實子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的存在性,尋找子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可能的標(biāo)記物,同時探索誘導(dǎo)分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞的方法。 方法 1.取包括5mm子宮肌層的子宮內(nèi)膜全層為樣本,采用機械和酶消化相結(jié)合的方法分離出人子宮內(nèi)膜細(xì)胞,用200目和400目的濾網(wǎng)兩次過濾后,分離出基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞,用波形蛋白和角蛋白免疫熒光染色鑒定基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。 2.部分樣本的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度至300個基質(zhì)細(xì)胞/cm2和500個上皮細(xì)胞/cm2。培養(yǎng)15d,對細(xì)胞的形態(tài)及生長特性進(jìn)行觀察；采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行抗原CD133、CD34、CD45、 CD90、CD73及CD29的表型鑒定。 3.另一部分樣本的基質(zhì)和上皮細(xì)胞用ALDEFLUOR檢測試劑盒標(biāo)記細(xì)胞并經(jīng)流式細(xì)胞儀分選。根據(jù)ALDH活性的強弱,分選出ALDHhigh細(xì)胞和ALDHlow細(xì)胞,用有限稀釋法培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度至300個基質(zhì)細(xì)胞/cm2和500個上皮細(xì)胞/cm2。對細(xì)胞的形態(tài)及生長特性進(jìn)行觀察；采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行抗原c-kit、CD90、CD73及CD29的表型鑒定。 4.培養(yǎng)基質(zhì)和上皮細(xì)胞,每天收集上清液作為條件培養(yǎng)液備用。在步驟2培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞中選取長勢良好的細(xì)胞,一部分用無菌的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo),即為實驗組。另一部分子宮內(nèi)膜干細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),即為對照組。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,用流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞CD13、CD9的表達(dá)。 結(jié)果 1.子宮內(nèi)膜干細(xì)胞原代培養(yǎng)、觀察及鑒定 (1)鏡下見剛貼壁的上皮細(xì)胞呈多角形或橢圓形,基質(zhì)細(xì)胞呈梭形。 (2)在培養(yǎng)上皮細(xì)胞的第5d左右,發(fā)現(xiàn)大約5～10個細(xì)胞形成巢狀結(jié)構(gòu),培養(yǎng)到8～9d時大多數(shù)細(xì)胞凋亡,巢狀結(jié)構(gòu)消失,上皮細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)克隆形成。 (3)基質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)的第3～4d開始增殖,在第15d中止培養(yǎng)時,可見有含松散排列細(xì)胞組成的小克隆存在,也有排列緊密小細(xì)胞的較大克隆出現(xiàn)。未經(jīng)ALDH分選的基質(zhì)細(xì)胞克隆形成率達(dá)1.34%±0.44%,大克隆和小克隆的形成率分別為0.02%±0.06%和1.32%±0.44%。細(xì)胞呈纖維樣,排列呈輻射狀。 (4)流式細(xì)胞檢測子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表現(xiàn)出CD29、CD90、CD73陽性,CD34、 CD45、CD133陰性。 2.乙醛脫氫酶活性檢測子宮內(nèi)膜干細(xì)胞 (1)經(jīng)過ALDH分選發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞中ALDHhigh細(xì)胞占1.88%±0.17%,上皮細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)ALDHhigh細(xì)胞。 (2)經(jīng)過15d的原代培養(yǎng),ALDHhigh基質(zhì)細(xì)胞的克隆形成較多,克隆形成率4.50%±0.82%, ALDHlow細(xì)胞的克隆形成率為1.06%±0.34%(P0.001)。ALDHhigh細(xì)胞和ALDHlow細(xì)胞中大克隆的形成率分別為0.11%±0.12%和0.04%±0.08%(P0.001)。ALDHhigh和ALDHlow細(xì)胞中小克隆的形成率分別為4.40%±0.81%和1.02%±0.30%(P0.001) (3)流式細(xì)胞檢測子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表現(xiàn)出c-kit、CD29、CD90、CD73陽性。 3.子宮內(nèi)膜干細(xì)胞在條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后的培養(yǎng)、觀察及鑒定 (1)對照組子宮內(nèi)膜干細(xì)胞呈梭形,外形輪廓不清楚,胞漿豐富透明,呈現(xiàn)中間稍寬,兩端尖的形態(tài),排列緊密,呈放射狀。 (2)實驗組子宮內(nèi)膜干細(xì)胞可見少數(shù)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變,部分細(xì)胞呈團(tuán)狀排列生長,呈多角形的上皮細(xì)胞改變,部分細(xì)胞分散生長,呈較扁平、紡錘體狀的基質(zhì)細(xì)胞改變。 (3)實驗組子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的CD13表達(dá)率為8.37%±0.51%,對照組的CD13表達(dá)率為1.88%±0.22%(P0.001)。同時實驗組子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的CD9表達(dá)率為9.24%0.90%,對照組的CD9表達(dá)率為1.68%±0.25%(P0.001)。 討論 近年有研究表明子宮內(nèi)膜存在具有高度增殖、自我更新和分化潛能的干細(xì)胞,本實驗結(jié)果證實子宮內(nèi)膜中存在干細(xì)胞,實驗在基質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了兩種不同大小的克隆,Chan RW等的研究認(rèn)為大克隆是由子宮內(nèi)膜前體細(xì)胞或干細(xì)胞起源的,而小克隆起源于子宮內(nèi)膜前體細(xì)胞分化而來的子代暫時增殖細(xì)胞(transit amplifying, TA), TA細(xì)胞增殖能力較干細(xì)胞較弱,并最終僅分化為具有不同功能、沒有增殖能力的終末細(xì)胞。本實驗培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞經(jīng)流式鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD29、CD90、CD73陽性,上皮干細(xì)胞因子CD133陰性,而造血細(xì)胞的表面標(biāo)志物如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34和CD45的表達(dá)均呈陰性,子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的表面標(biāo)記物與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物大體一致,提示可能來源于間充質(zhì)干細(xì)胞。 ALDH1可能在干細(xì)胞的早期分化中起重要作用,在多種組織類型的腫瘤干細(xì)胞中呈高表達(dá),而高表達(dá)ALDH1的細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性。目前,研究證實子宮內(nèi)膜中存在干細(xì)胞,但子宮內(nèi)膜干細(xì)胞所占子宮內(nèi)膜總細(xì)胞比例很低,且缺乏特異性的標(biāo)記物。本實驗在子宮內(nèi)膜干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶活性高的細(xì)胞,且具有更高的集落形成能力,為將來有效富集子宮內(nèi)膜干細(xì)胞提供方法。發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞表達(dá)c-kit陽性,c-kit是原癌基因,又叫干細(xì)胞因子受體,可編碼一種穿膜酪氨酸激酶受體分子。存在于造血干細(xì)胞膜上,它的配體分子是造血干細(xì)胞因子,表達(dá)此表面抗原可以作為鑒定子宮內(nèi)膜干細(xì)胞樣細(xì)胞的一個標(biāo)記物。 本實驗利用子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜基質(zhì)樣和上皮樣的細(xì)胞,使得合成具有完整解剖結(jié)構(gòu)和良好功能的子宮內(nèi)膜成為可能。初步證明了在體外的誘導(dǎo)條件下,子宮內(nèi)膜干細(xì)胞具有向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化的巨大潛能。隨著對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞研究的深入,誘導(dǎo)內(nèi)膜干細(xì)胞向內(nèi)膜細(xì)胞分化,治療內(nèi)膜損傷,為子宮內(nèi)膜過薄和有宮腔粘連的婦女進(jìn)行內(nèi)膜修復(fù)將成為可能。迄今為止,國內(nèi)外學(xué)者對宮腔粘連的發(fā)病機制進(jìn)行了大量研究,一致認(rèn)為子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙可能是宮腔粘連形成的主要機制,在病理情況下,如流產(chǎn)后刮宮或其它宮腔操作后,子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙,結(jié)果瘢痕形成,粘連發(fā)生。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞減少或缺失可能與子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙、宮腔粘連發(fā)病機制密切相關(guān),本實驗通過子宮內(nèi)膜干細(xì)胞體外向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化,從干細(xì)胞層面探討宮腔粘連移植治療的可行性,這項研究將對探尋新的宮腔粘連治療方案、提高宮腔粘連治愈率及妊娠率具有重要意義。但是,誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞后進(jìn)一步分化為子宮內(nèi)膜的可能性,需進(jìn)一步做嚴(yán)格的動物實驗,進(jìn)行深入細(xì)致的探究,目前,我們的研究團(tuán)隊正在做干細(xì)胞治療宮腔粘連的動物實驗,另外,子宮內(nèi)膜干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化的分子機制以及分化后細(xì)胞的功能有待于進(jìn)一步研究。 結(jié)論 1.實驗證明在人子宮內(nèi)膜中存在少量具有克隆形成能力和高度增生潛能的干細(xì)胞,這些干細(xì)胞可能來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.乙醛脫氫酶活性高的細(xì)胞具有更強的集落形成能力,并表達(dá)部分干細(xì)胞表面標(biāo)志。 3.子宮內(nèi)膜混合細(xì)胞培養(yǎng)上清液對子宮內(nèi)膜干細(xì)胞具有定向誘導(dǎo)分化作用,但誘導(dǎo)不完全,具體機制仍需深入研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙鵬;李玉明;;大鼠心肌勻漿上清液對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響[J];中國病理生理雜志;2005年12期

2 楊彪;梅晰凡;劉福強;秦書儉;;損傷脊髓組織提取液對大鼠肌源性干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗研究[J];中國臨床解剖學(xué)雜志;2008年05期

3 孫旭芳;姜煥榮;楊紅;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及其向視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗研究[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2007年16期

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本文編號：2425799