【摘要】：神經(jīng)系統(tǒng)損傷及神經(jīng)退行性疾病所造成的神經(jīng)功能缺損一直是困擾人類健康的難題,也是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。長(zhǎng)期以來(lái)的研究表明,神經(jīng)細(xì)胞本身缺乏再生能力。迄今為止,已有的藥物治療只是對(duì)癥治療,而不能從根本上解決神經(jīng)細(xì)胞缺失的問(wèn)題,更無(wú)法治愈該類疾病。 干細(xì)胞在特定微環(huán)境條件下,能夠被誘導(dǎo)分化成為多種組織細(xì)胞,通過(guò)移植給受者參與組織的再生與修復(fù),為臨床醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)新的充滿希望的治療手段,可用于治療修復(fù)一些曾經(jīng)被人類認(rèn)為是不可再生的組織器官。干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展,為治療甚至治愈神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性疾病提供了可能。目前研究較多的干細(xì)胞類型包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞。 間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)于其他干細(xì)胞,如胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等具有多方面的優(yōu)勢(shì),因此備受關(guān)注。多項(xiàng)研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病和腦血管疾病都有積極的治療意義。臍帶由于具有采集方便,免疫原性低,病毒污染率低,不涉及社會(huì)、倫理及法律方面爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn),可以作為間充質(zhì)干細(xì)胞的理想來(lái)源。 目前,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外神經(jīng)分化的方法主要有化學(xué)試劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)法,但化學(xué)試劑如丁基羥基苯甲醚,二甲亞砜、β-巰基乙醇等或多或少對(duì)細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性；而細(xì)胞因子bFGF、EGF、BDNF等由于是大分子蛋白質(zhì)不易通過(guò)血腦屏障,因此限制了它們進(jìn)一步應(yīng)用于臨床。 神經(jīng)甾體(neurosteroids)是一類由神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞合成、代謝產(chǎn)生的具有神經(jīng)活性甾類物質(zhì)的總稱,主要包括孕烯醇酮(pregnenolone, PREG)、孕酮(progesterone, PROG)及別孕烯醇酮(allopregnanolone, AP)等。大量研究顯示,神經(jīng)甾體不僅參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響；對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)以及促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元存活作用；同時(shí),神經(jīng)甾體作為小分子物質(zhì)易通過(guò)血腦屏障而發(fā)揮作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道,孕酮及其代謝物別孕烯醇酮促進(jìn)干細(xì)胞的增殖與分化。 目的：采用組織塊法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,通過(guò)應(yīng)用含腦組織的培養(yǎng)液來(lái)模擬腦內(nèi)微環(huán)境,考察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。在此基礎(chǔ)上,采用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)方法對(duì)細(xì)胞分化過(guò)程中主要神經(jīng)甾體的合成代謝水平的變化進(jìn)行研究。隨后,探討其中具有作用潛力的孕酮在模擬腦內(nèi)微環(huán)境中對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響,并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,以期為臨床治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)變性病提供新的思路和依據(jù)。 方法： 1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化及生物學(xué)特性 取足月、健康的順產(chǎn)胎兒臍帶,PBS沖洗,剝除動(dòng)、靜脈血管,分離獲得wharton's jelly (華爾通)膠,充分剪碎至約1mm3大小,置于含有10%胎牛血清(FBS),100U/mL青霉素,100U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中,在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUMSCs),傳代、純化、擴(kuò)增。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代hUMSCs,用0.25%的胰酶/EDTA消化,制成單細(xì)胞懸液,分別加入抗人的HLA-DR-FITC、CD34-PE. CD45-PC5、CD29-FITC和CD105-PE單克隆抗體,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代hUMSCs以2×104/孔的密度接種在6孔板內(nèi),以DMEM/F12含10%FBS,10-6M地塞米松,50mg/L抗壞血酸,100mg/L1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤,100U/ml青霉素和100U/mL鏈霉素對(duì)hUMSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。以DMEM/F12含10%FBS,50mg/L抗壞血酸,10-8M地塞米松,10mmol/Lp-甘油磷酸,100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素對(duì)hUMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。14d后,采用油紅O染色檢測(cè)脂肪滴,用VonKossa染色檢測(cè)鈣化基質(zhì)沉淀。 2腦組織微環(huán)境對(duì)hUMSCs分化的影響 SD雄性大鼠斷頭取出腦組織,置于冰上,稱取濕重,按150g/L加入DMEM/F12培養(yǎng)基,用勻漿器在冰浴中將腦組織勻漿,低溫高速離心(5000g,10min)后吸取上清液,得到含腦組織的培養(yǎng)液(腦組織勻漿上清)。將培養(yǎng)的第3代hUMSCs制成單細(xì)胞懸液,以1×105/mL的細(xì)胞密度接種于24孔板中,制備細(xì)胞爬片,孔內(nèi)預(yù)先鋪有經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片,待細(xì)胞貼壁伸展后加入誘導(dǎo)液(腦組織勻漿上清+100U/mL青霉素+100U/mL鏈霉素),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。于培養(yǎng)后的第3d,取出蓋玻片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin,神經(jīng)元表面標(biāo)志物NSE及膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物GFAP的表達(dá),并進(jìn)行甲苯胺蘭染色鑒定尼氏體。 3hUMSCs在腦組織微環(huán)境分化過(guò)程中主要神經(jīng)甾體及3β-HSD的變化 將培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代hUMSCs制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度以1×105/mL的細(xì)胞密度接種于24孔板中,待細(xì)胞貼壁伸展后去掉培養(yǎng)基,進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。分為對(duì)照組(DMEM/F12+10%FBS)和腦組織勻漿上清組。分別于培養(yǎng)的0、1、3、7d收集細(xì)胞培養(yǎng)液,1000r·min-1離心5min,收集上清液,用乙酸乙酯/正己烷萃取,以固相萃取法進(jìn)行純化,加入內(nèi)標(biāo)甲睪酮,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品與2-硝基-4-三氟甲基苯肼(2-nitro-4-trifluoromethyphenylhydrazine,2NFPH)衍生化,采用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定孕烯醇酮(PREG)、孕酮(PROG)和別孕烯醇酮(AP)的含量。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)3β-羥基甾醇脫氫酶(3β-HSD)的表達(dá)變化。 4孕酮在腦組織微環(huán)境中對(duì)hUMSCs分化的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代hUMSCs,按1×106/孔密度接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁伸展后去掉培養(yǎng)基,進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。對(duì)照組培養(yǎng)基為腦組織勻漿上清,實(shí)驗(yàn)組在腦組織勻漿上清中加入不同濃度的PROG,使終濃度分別為0.1μM、1μM、10μM。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。培養(yǎng)3d后,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞NSE表達(dá)情況。在RT-PCR得到PROG促進(jìn)分化的最佳濃度的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分化后細(xì)胞NSE、nestin、GFAP的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 5孕酮對(duì)hUMSCs分化過(guò)程中BDNF水平的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代hUMSCs,1×105/mL的密度種植于24孔板中,待細(xì)胞伸展后,棄去培養(yǎng)基,加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。分為①對(duì)照組：DMEM/F12+10%FBS;②腦組織勻漿上清組；(DPROG (1μM)+腦組織勻漿上清組。分別于培養(yǎng)后的0、1、3、7d收取培養(yǎng)液,1000r·min-1,離心,取上清,用酶聯(lián)免疫法測(cè)檢腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的水平。 結(jié)果： 1hUMSCs的培養(yǎng)與鑒定 人臍帶wharton's jelly膠組織塊培養(yǎng)約3-5d后,倒置顯微鏡下可見(jiàn)組織塊間隙散在分布的長(zhǎng)條索狀紡錘型細(xì)胞,2w左右細(xì)胞達(dá)到80-90%融合,呈放射狀或漩渦狀分布。經(jīng)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞增殖迅速,可得到純化的成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞約4-5d即可達(dá)到80%-90%融合。流式細(xì)胞儀檢測(cè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志,不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞標(biāo)志和人類白細(xì)胞抗原HLA-DR。以成脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后,大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄�、肥大、�?nèi)含大量可被油紅著色的多角形脂肪細(xì)胞；以成骨分化方案誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后,細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形,可見(jiàn)VonKossa染色陽(yáng)性細(xì)胞。 2hUMSCs在模擬腦內(nèi)微環(huán)境中向神經(jīng)細(xì)胞分化 hUMSCs在腦組織勻漿上清中培養(yǎng)約12h后,細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生變化,細(xì)胞質(zhì)向核收縮,胞體變小,呈不規(guī)則形或圓形。培養(yǎng)72h,部分細(xì)胞可見(jiàn)兩個(gè)或多個(gè)突起伸出,類似神經(jīng)細(xì)胞,有些細(xì)胞呈簡(jiǎn)單的雙極或多極,細(xì)胞之間有簡(jiǎn)單的交聯(lián)。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后在鏡下可觀察到：多數(shù)細(xì)胞分別呈nestin、NSE及GFAP陽(yáng)性表達(dá)。甲苯胺藍(lán)染色后鏡下可觀察到胞質(zhì)中存在著深藍(lán)色顆粒狀的尼氏小體。 3hUMSCs在模擬腦內(nèi)微環(huán)境中向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中主要神經(jīng)甾體及3β-HSD的變化 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基組,PROG濃度低于最低定量限。腦勻漿上清培養(yǎng)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PROG的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高,0d：1.78±0.50ng/mL；1d：2.88±0.29ng/mL；3d：7.51±0.65ng/mL；7d：10.56±0.65ng/mL,差異顯著(P0.05)�；A(chǔ)培養(yǎng)基中可檢測(cè)到PREG,隨著hUMSCs培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),PREG水平未見(jiàn)顯著變化(P0.05)；在腦組織勻漿上清中可檢測(cè)到PREG,隨著hUMSCs培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),PREG水平逐漸降低,0d：14.74±0.63ng／mL；ld：12.34±0.56ng／mL；3d：10.62±0.32ng／mL；7d：8.61±0.50ng／mL,差異顯著(P0.05)�；A(chǔ)培養(yǎng)基與腦組織勻漿上清培養(yǎng)組的AP濃度均低于最低定量限。 與對(duì)照組相比,hUMSCs在腦勻漿上清中培養(yǎng)的細(xì)胞中顯示3β-HSD表達(dá),且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,表達(dá)增強(qiáng)。 4孕酮在體外模擬腦內(nèi)微環(huán)境中對(duì)hUMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響 PROG處理后,hUMSCs的形態(tài)與單純腦組織勻漿上清培養(yǎng)相比變化更加明顯,神經(jīng)細(xì)胞的特征形態(tài)出現(xiàn)的時(shí)間更早,并且細(xì)胞之間發(fā)生明顯的交聯(lián)。 RT-PCR結(jié)果顯示,與含腦組織勻漿上清培養(yǎng)液培養(yǎng)相比,加入PROG處理后可促進(jìn)hUMSCs向神經(jīng)元分化,且1μM為最適宜濃度。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)了1μMPROG處理3d后細(xì)胞NSE、nestin、GFAP的表達(dá),結(jié)果顯示,1μMPROG處理組中NSE表達(dá)顯著高于對(duì)照組,58.40±8.22%vs22.15±1.41%(P0.05),nestin表達(dá)顯著低于對(duì)照組,24.60±2.86%vs35.07±1.95%(P0.05),GFAP表達(dá)無(wú)顯著性差異,8.0±1.05%vs7.07±0.64%(P0.05)。 5孕酮對(duì)hUMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程時(shí)微環(huán)境中BDNF水平的影響 與對(duì)照組相比,腦勻漿上清培養(yǎng)組與PROG處理組中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中BDNF的濃度均顯著升高(P0.05),而PROG處理后BDNF的濃度與單純腦勻漿上清培養(yǎng)相比也有顯著升高(P0.05)。 結(jié)論： 1應(yīng)用組織塊貼壁培養(yǎng)法能夠從臍帶wharton's jelly膠中培養(yǎng)出大量增殖能力較強(qiáng)、具有多向分化能力的成纖維樣細(xì)胞,其高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志,不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志和人類白細(xì)胞抗原,證實(shí)了臍帶可作為MSCs的重要來(lái)源。 2hUMSCs在腦組織微環(huán)境下培養(yǎng),顯示神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。分化后的細(xì)胞經(jīng)nestin、GFAP及NSE免疫染色和尼氏體染色均表達(dá)陽(yáng)性,提示,hUMSCs在腦組織微環(huán)境中分化為神經(jīng)細(xì)胞,其分化方式可能是先分化為神經(jīng)干細(xì)胞再向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。 3在腦組織微環(huán)境培養(yǎng)hUMSCs過(guò)程中,PROG隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),生成顯著增多,PREG水平顯著降低。說(shuō)明分化后細(xì)胞能夠合成、分泌神經(jīng)甾體,具有功能性神經(jīng)細(xì)胞的特性。同時(shí)提示PROG可能在腦組織微環(huán)境促進(jìn)hUMSCs(?)神經(jīng)分化過(guò)程中扮演了角色。 4PROG處理可以提高h(yuǎn)UMSCs在腦組織微環(huán)境中的神經(jīng)分化速度,并且促進(jìn)hUMSCs向神經(jīng)元方向分化,這對(duì)該類干細(xì)胞移植用于相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有重要意義。 5腦組織微環(huán)境及其中的PROG可顯著增加分化中的hUMSCs合成BDNF的能力。對(duì)BDNF的調(diào)節(jié)可能是微環(huán)境及PROG促進(jìn)hUMSCs神經(jīng)分化的機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2423981