【摘要】：研究內(nèi)容與目的： TGF-β1是Toll樣受體(toll like receptor, TLR)信號通路中重要的負(fù)性調(diào)控因子,它可以誘導(dǎo)包括B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞發(fā)生凋亡,LPS刺激可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1,此外LPS刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡且這種促凋亡作用與TLR4密切相關(guān),然而關(guān)于LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡是否與促巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1相關(guān)未有相關(guān)報(bào)道。本課題旨在觀察TGF-β1是否具有調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的作用,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討TGF-β1對TLR4受體表達(dá)以及對TLR4信號通路中相關(guān)信號分子的影響。 研究方法與結(jié)果： 本課題實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行： 第一部分檢測TGF-β1對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的影響,包括以下三個實(shí)驗(yàn)： 1.流式細(xì)胞儀檢測LPS刺激對巨噬細(xì)胞凋亡的影響,ELISA檢測LPS刺激后巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1的情況：采用100ng/ml、1000ng/ml LPS刺激巨噬細(xì)胞12小時(shí),檢測結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡并促進(jìn)RAW264.7分泌TGF-β1且這種作用有劑量依賴性； 2.流式細(xì)胞儀檢測TGF-β1對巨噬細(xì)胞凋亡的影響；分別用5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞12小時(shí),結(jié)果顯示TGF-β1具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的作用且有劑量依賴性； 3.流式細(xì)胞儀檢測TGF-β1對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的影響；100ng/ml LPS刺激的前提下分別加入Ong/ml、5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞12小時(shí),結(jié)果顯示TGF-β1促進(jìn)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡,且為劑量依賴性。 第二部分檢測TGF-β1對炎性巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測TLR4蛋白表達(dá)以及實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測TLR4mRNA的表達(dá)水平,包括以下三個實(shí)驗(yàn)： 1.檢測LPS刺激對巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)水平的影響；首先檢測100ng/ml、1000ng/ml LPS刺激巨噬細(xì)胞12小時(shí)TLR4的表達(dá)情況,結(jié)果顯示LPS抑制巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá),且有劑量依賴性；檢測100ng/ml LPS刺激不同時(shí)間巨噬細(xì)TLR4的表達(dá)情況,結(jié)果顯示100ng/ml LPS刺激6小時(shí)對巨噬細(xì)胞TLR4mRNA的抑制作用最顯著,對TLR4蛋白表達(dá)的抑制作用在刺激12小時(shí)最顯著； 2.檢測TGF-β1對巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)水平的影響；首先檢測5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞12小時(shí)TLR4的表達(dá)情況,結(jié)果顯示TGF-β1抑制巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)；檢測lOng/ml TGF-β1刺激不同時(shí)間巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)情況,結(jié)果顯示TGF-β1抑制巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)有時(shí)間依賴性； 3.檢測TGF-β1與LPS聯(lián)合刺激對巨噬細(xì)胞TLR4基因和蛋白表達(dá)水平的影響：這部分實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組,100ng/ml LPS組,10ng/ml TGF-β1組,LPS與TGF-β1聯(lián)合刺激組,1μg/ml anti-TGF-β1組,LPS與anti-TGF-β1聯(lián)合刺激組。檢測結(jié)果顯示,LPS與TGF-β1聯(lián)合刺激對巨噬細(xì)胞TLR4基因及蛋白表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于LPS或TGF-β1單獨(dú)刺激組,anti-TGF-β1中和巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1可使LPS抑制TLR4的作用減弱,但不能完全阻斷其抑制作用,此結(jié)果表明二者在抑制TLR4表達(dá)上具有相關(guān)性,但LPS抑制TLR4表達(dá)并非TGF-β1依賴。 第三部分檢測TGF-β1對TLR4信號傳導(dǎo)中的相關(guān)信號分子表達(dá)的影響；實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR技術(shù)檢測SOCS3mRNA以及BAMBI mRNA的表達(dá)。包括以下兩部分實(shí)驗(yàn)： 1.檢測TGF-β1與LPS單獨(dú)或聯(lián)合刺激以及加入anti-TGF-β1以后LPS刺激對巨噬細(xì)胞SOCS3mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果顯示LPS或TGF-β1單獨(dú)刺激具有促進(jìn)SOCS3mRNA表達(dá)的作用,聯(lián)合刺激與LPS或TGF-β1單獨(dú)刺激組間區(qū)別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,anti-TGF-β1與LPS聯(lián)合刺激組SOCS3mRNA表達(dá)水平與LPS單獨(dú)刺激組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 2.重復(fù)上述細(xì)胞刺激方案,檢測巨噬細(xì)胞BAMBI mRNA的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,LPS或TGF-β1單獨(dú)刺激具有抑制BAMBI mRNA表達(dá)的作用,聯(lián)合刺激組BAMBI mRNA的表達(dá)水平與單獨(dú)刺激組無明顯差別,加入anti-TGF-β1以后,LPS刺激對BAMBI mRNA的抑制作用于與LPS單獨(dú)刺激組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.LPS促巨噬細(xì)胞凋亡的作用與刺激巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1相關(guān),TGF-β1具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡的作用,LPS與TGF-β1聯(lián)合刺激的促凋亡作用增強(qiáng)； 2.TGF-β1具有抑制巨噬細(xì)胞TLR4基因及蛋白表達(dá)的作用,LPS抑制巨噬細(xì)胞TLR4基因及蛋白的表達(dá)與促巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1相關(guān),但并非TGF-β1依賴； 3.TGF-β1或LPS單獨(dú)刺激可抑制巨噬細(xì)胞BAMBI基因表達(dá)與促進(jìn)巨噬細(xì)胞SOCS3基因表達(dá),但本實(shí)驗(yàn)未能證明二者聯(lián)合刺激對BAMBI及SOCS3基因表達(dá)的影響具有協(xié)同作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2420593