【摘要】：研究內(nèi)容與目的： TGF-β1是Toll樣受體(toll like receptor, TLR)信號通路中重要的負性調(diào)控因子,它可以誘導(dǎo)包括B細胞、嗜酸性粒細胞等多種類型的細胞發(fā)生凋亡,LPS刺激可促進巨噬細胞分泌TGF-β1,此外LPS刺激可誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生凋亡且這種促凋亡作用與TLR4密切相關(guān),然而關(guān)于LPS誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡是否與促巨噬細胞分泌TGF-β1相關(guān)未有相關(guān)報道。本課題旨在觀察TGF-β1是否具有調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡的作用,并在此基礎(chǔ)上進一步探討TGF-β1對TLR4受體表達以及對TLR4信號通路中相關(guān)信號分子的影響。 研究方法與結(jié)果： 本課題實驗分三部分進行： 第一部分檢測TGF-β1對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7凋亡的影響,包括以下三個實驗： 1.流式細胞儀檢測LPS刺激對巨噬細胞凋亡的影響,ELISA檢測LPS刺激后巨噬細胞分泌TGF-β1的情況：采用100ng/ml、1000ng/ml LPS刺激巨噬細胞12小時,檢測結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7凋亡并促進RAW264.7分泌TGF-β1且這種作用有劑量依賴性； 2.流式細胞儀檢測TGF-β1對巨噬細胞凋亡的影響；分別用5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細胞12小時,結(jié)果顯示TGF-β1具有誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7凋亡的作用且有劑量依賴性； 3.流式細胞儀檢測TGF-β1對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7凋亡的影響；100ng/ml LPS刺激的前提下分別加入Ong/ml、5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細胞12小時,結(jié)果顯示TGF-β1促進LPS誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生凋亡,且為劑量依賴性。 第二部分檢測TGF-β1對炎性巨噬細胞TLR4表達的影響,實驗采用流式細胞儀檢測TLR4蛋白表達以及實時定量PCR(Real-time PCR)檢測TLR4mRNA的表達水平,包括以下三個實驗： 1.檢測LPS刺激對巨噬細胞TLR4表達水平的影響；首先檢測100ng/ml、1000ng/ml LPS刺激巨噬細胞12小時TLR4的表達情況,結(jié)果顯示LPS抑制巨噬細胞TLR4的表達,且有劑量依賴性；檢測100ng/ml LPS刺激不同時間巨噬細TLR4的表達情況,結(jié)果顯示100ng/ml LPS刺激6小時對巨噬細胞TLR4mRNA的抑制作用最顯著,對TLR4蛋白表達的抑制作用在刺激12小時最顯著； 2.檢測TGF-β1對巨噬細胞TLR4表達水平的影響；首先檢測5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細胞12小時TLR4的表達情況,結(jié)果顯示TGF-β1抑制巨噬細胞TLR4的表達；檢測lOng/ml TGF-β1刺激不同時間巨噬細胞TLR4的表達情況,結(jié)果顯示TGF-β1抑制巨噬細胞TLR4表達有時間依賴性； 3.檢測TGF-β1與LPS聯(lián)合刺激對巨噬細胞TLR4基因和蛋白表達水平的影響：這部分實驗分組如下：對照組,100ng/ml LPS組,10ng/ml TGF-β1組,LPS與TGF-β1聯(lián)合刺激組,1μg/ml anti-TGF-β1組,LPS與anti-TGF-β1聯(lián)合刺激組。檢測結(jié)果顯示,LPS與TGF-β1聯(lián)合刺激對巨噬細胞TLR4基因及蛋白表達的抑制作用強于LPS或TGF-β1單獨刺激組,anti-TGF-β1中和巨噬細胞分泌的TGF-β1可使LPS抑制TLR4的作用減弱,但不能完全阻斷其抑制作用,此結(jié)果表明二者在抑制TLR4表達上具有相關(guān)性,但LPS抑制TLR4表達并非TGF-β1依賴。 第三部分檢測TGF-β1對TLR4信號傳導(dǎo)中的相關(guān)信號分子表達的影響；實驗采用Real-time PCR技術(shù)檢測SOCS3mRNA以及BAMBI mRNA的表達。包括以下兩部分實驗： 1.檢測TGF-β1與LPS單獨或聯(lián)合刺激以及加入anti-TGF-β1以后LPS刺激對巨噬細胞SOCS3mRNA表達的影響,結(jié)果顯示LPS或TGF-β1單獨刺激具有促進SOCS3mRNA表達的作用,聯(lián)合刺激與LPS或TGF-β1單獨刺激組間區(qū)別無統(tǒng)計學(xué)意義,anti-TGF-β1與LPS聯(lián)合刺激組SOCS3mRNA表達水平與LPS單獨刺激組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義； 2.重復(fù)上述細胞刺激方案,檢測巨噬細胞BAMBI mRNA的表達情況,結(jié)果顯示,LPS或TGF-β1單獨刺激具有抑制BAMBI mRNA表達的作用,聯(lián)合刺激組BAMBI mRNA的表達水平與單獨刺激組無明顯差別,加入anti-TGF-β1以后,LPS刺激對BAMBI mRNA的抑制作用于與LPS單獨刺激組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.LPS促巨噬細胞凋亡的作用與刺激巨噬細胞分泌TGF-β1相關(guān),TGF-β1具有促進巨噬細胞凋亡的作用,LPS與TGF-β1聯(lián)合刺激的促凋亡作用增強； 2.TGF-β1具有抑制巨噬細胞TLR4基因及蛋白表達的作用,LPS抑制巨噬細胞TLR4基因及蛋白的表達與促巨噬細胞分泌TGF-β1相關(guān),但并非TGF-β1依賴； 3.TGF-β1或LPS單獨刺激可抑制巨噬細胞BAMBI基因表達與促進巨噬細胞SOCS3基因表達,但本實驗未能證明二者聯(lián)合刺激對BAMBI及SOCS3基因表達的影響具有協(xié)同作用。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2420593