【摘要】：研究背景及目的： 自然選擇法則決定了病毒進(jìn)化需要不斷擴展其入侵的宿主范圍。病毒基因組的高變性使得越來越多的遠(yuǎn)緣病毒進(jìn)化到感染人體并引發(fā)很多致死性傳染病的暴發(fā)流行。源于野生動物的的HIV、SARS病毒、禽流感病毒在人類的暴發(fā)與流行,從側(cè)面反應(yīng)了這一現(xiàn)狀。T病毒,這種更遠(yuǎn)緣的病毒會不會進(jìn)化到不識別特異性受體而直接入侵人類細(xì)胞?為了提前預(yù)知這種病毒的核酸是否可以在人體內(nèi)會產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng),本研究旨在觀查并分析T病毒RNA進(jìn)入Hela細(xì)胞后的復(fù)制情況,以及其是否能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡,并進(jìn)一步推斷細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用途徑是否與細(xì)胞內(nèi)天然免疫反應(yīng)密切相關(guān)。 研究內(nèi)容及方法： 第一部分,將T病毒RNA借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人類Hela細(xì)胞后,主要從蛋白、mRNA表達(dá)、形態(tài)學(xué)三方面驗證T病毒RNA在Hela細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況,包括：1) Western blotting檢測T病毒蛋白的表達(dá)；2)RT-RCR及實時定量PCR檢測T病毒基因組正負(fù)鏈的合成；3)Northern blotting檢測T病毒基因組和亞基因組的存在；4)通過電鏡(細(xì)胞切片、負(fù)染色及免疫膠體金染色)證明T病毒子代病毒顆粒在Hela細(xì)胞內(nèi)的存在；5) RT-RCR、Western blotting、電鏡(細(xì)胞切片、免疫膠體金染色)檢測病毒在細(xì)胞間及病毒從細(xì)胞到植物或裸鼠體內(nèi)的傳代表達(dá)情況。 第二部分,采用IF-RNA-FISH技術(shù)對T病毒基因組和蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位；同時采用活細(xì)胞動態(tài)成像技術(shù)示蹤T病毒RNA在Hela細(xì)胞內(nèi)的運動軌跡。 第三部分,本小組前期研究推斷T病毒RNA導(dǎo)入后可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(Endoplasmic reticulum stress, ERS)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生自噬(Autophagy)。自噬作為天然免疫防御機制之一,在抗感染晚期促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此,本部分通過Anecin V-PI染色流式對Hela細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測。為了分析凋亡的相關(guān)作用途徑,首先采用Western blotting及流式細(xì)胞術(shù)檢測自噬基因LC3的表達(dá),確認(rèn)自噬的發(fā)生；然后采用RT-RCR及Western blotting檢測GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的表達(dá),確認(rèn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生；最后借助電鏡及活細(xì)胞動態(tài)成像技術(shù)觀察并分析T病毒核酸、蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)及自噬(Autophagy)間的相互作用關(guān)系。 研究結(jié)果： 1.T病毒RNA導(dǎo)入Hela細(xì)胞后不僅合成了自身核酸、蛋白,組裝出了T病毒子代病毒顆粒,而且還可以在Hela細(xì)胞間以及從Hela細(xì)胞到T病毒宿主或裸鼠體內(nèi)傳代表達(dá),說明其在Hela細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了復(fù)制,且具有很高的生物學(xué)活性。 2.IF-RNA-FISH結(jié)果顯示：隨轉(zhuǎn)染時間的延長,T病毒部分核酸逐漸從細(xì)胞質(zhì)聚集于細(xì)胞核核仁；T病毒蛋白(CP)始終定位于細(xì)胞質(zhì)中�；罴�(xì)胞動態(tài)成像也顯示了T病毒RNA從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)到細(xì)胞核的運動軌跡。 3.流式檢測結(jié)果顯示：T病毒RNA導(dǎo)入后Hela細(xì)胞發(fā)生了凋亡。除確認(rèn)自噬發(fā)生(自噬基因LC3蛋白的轉(zhuǎn)化、高表達(dá)；電鏡下出現(xiàn)典型的自噬體及自噬溶酶體、自噬空泡數(shù)量顯著增多)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生(GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的高表達(dá))外,免疫電鏡結(jié)果顯示：部分T病毒蛋白出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、自噬體膜及核膜附近,且隨時間延長聚集于自噬體膜表面,同時電鏡結(jié)果提示自噬體膜可能來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜擴張導(dǎo)致自噬前體形成,T病毒蛋白隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張部分進(jìn)入自噬體,或被自噬機制降解或利用自噬存活；雙光子共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示T病毒RNA與一些GFP-LC3標(biāo)記的自噬小體共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),且活細(xì)胞動態(tài)成像結(jié)果呈現(xiàn)了T病毒RNA從進(jìn)入細(xì)胞到與自噬體融合的運動軌跡,這一過程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,推斷T病毒RNA的復(fù)制行為導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞自噬,自噬后期誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 研究意義： 病毒的進(jìn)化和人類的探索活動拉近了人與不同物種間的距離,跨生物界生命物質(zhì)比以往任何時候都更容易發(fā)生交叉與融和。病毒本身的高度變異,使得病毒能否入侵人體細(xì)胞,已經(jīng)不完全決定于特異性受體的有無。該課題瞄準(zhǔn)跨生物界遠(yuǎn)緣病毒入侵這一空白研究領(lǐng)域,以對人類無特異性受體、無主動侵襲性的T病毒和人類宮頸癌Hela細(xì)胞系為模型,首次對T病毒對非宿主細(xì)胞的作用機制進(jìn)行了較為系統(tǒng)和深入的研究,突破原有的病毒相關(guān)細(xì)胞膜受體研究思路,從一個全新的角度探索病毒預(yù)防的策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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7 張s，

本文編號：2420497