發(fā)布時(shí)間：2019-02-09 11:28

【摘要】：哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中，其基因組是轉(zhuǎn)錄沉默的。在小鼠，廣泛的胚胎基因組激活于2細(xì)胞晚期開始；在人，胚胎基因組的激活發(fā)生于4-8細(xì)胞期。在胚胎基因組激活之前，胚胎的發(fā)育由卵細(xì)胞發(fā)生過程中積累并儲(chǔ)存于成熟卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的母源因子(包括mRNA和蛋白質(zhì))所調(diào)控。在卵子受精或核移植的胚胎激活后，這些母源因子啟動(dòng)早期胚胎的發(fā)育，胚胎基因組開始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)新的基因，合成新的因子，并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成更多的細(xì)胞因子，維持早期胚胎繼續(xù)發(fā)育。即使在胚胎基因組激活后，持續(xù)存在的母源因子仍可與其它的母源因子一起，或者通過與新表達(dá)的合子基因產(chǎn)物相互作用促進(jìn)早期胚胎發(fā)育。因此對(duì)母源因子的研究，將有助于我們深入了解早期胚胎發(fā)育過程中的重要事件和調(diào)控機(jī)制，并為尋找早期體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育失敗的原因以及提高體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育的成功率提供理論基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法從小鼠的MII期卵母細(xì)胞蛋白譜系中鑒定出RNF114（RING finger protein114）蛋白，它是一個(gè)在卵母細(xì)胞中缺乏相應(yīng)的功能研究的蛋白質(zhì)，同時(shí)另有研究證實(shí)RNF114蛋白在胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后均有表達(dá)，且在胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后表達(dá)量較未分化時(shí)降低。我們研究證實(shí)其mRNA在卵細(xì)胞及受精卵中表達(dá)量最高，卵裂后其表達(dá)量顯著下降并在早期胚胎中維持較低的表達(dá)水平，而熒光定位顯示RNF114蛋白自小鼠GV期卵母細(xì)胞到囊胚階段持續(xù)表達(dá)。以上結(jié)果提示我們，在小鼠合子基因組轉(zhuǎn)錄激活后，RNF114基因的轉(zhuǎn)錄活性低，RNF114mRNA和/或蛋白質(zhì)主要在卵細(xì)胞成熟的過程中聚集,可能作為一個(gè)母源性因子在早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用。此外，對(duì)RNF114進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析顯示該蛋白有一個(gè)RING finger結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)C2H2zinc finger結(jié)構(gòu)域，提示我們RNF114在早期胚胎中可能作為一個(gè)E3連接酶，通過對(duì)下游底物的泛素化，調(diào)節(jié)其降解或轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。 我們首先用兩對(duì)siRNAs特異性阻斷RNF114蛋白在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的功能，觀察到囊胚的形成率降低且囊胚細(xì)胞數(shù)目減少，并且囊胚中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞構(gòu)成比發(fā)生偏移（內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)減少高于滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)減少）。此外，我們還通過體外底物非依賴泛素化反應(yīng)驗(yàn)證了RNF114蛋白的E3活性，并且通過蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選到了40種底物蛋白。隨后我們利用底物依賴的體外泛素化反應(yīng)和Western blot的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)部分底物蛋白分別進(jìn)行了體外和體內(nèi)的驗(yàn)證，證實(shí)了Cd74、Optn、Psat1、Rab3il1、Tnip1這5個(gè)蛋白確實(shí)為RNF114的底物，此外也證實(shí)了RNF114作為一個(gè)E3泛素連接酶介導(dǎo)了底物蛋白的降解。前人已有報(bào)道過表達(dá)Tnip1和Optn蛋白能抑制腫瘤壞死因子（TNF）誘導(dǎo)的NF-kB活性從而導(dǎo)致細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖受阻，細(xì)胞凋亡增加；同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道過表達(dá)Cd74可通過正反饋調(diào)節(jié)ERK活性從而破壞ES細(xì)胞的全能性并促進(jìn)分化。因此，我們推測(cè)RNF114通過對(duì)一些參與ERK/NF-kB信號(hào)通路的相關(guān)因子進(jìn)行泛素化修飾，調(diào)節(jié)其降解途徑，從而參與早期胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、胚胎全能性維持等多種生物學(xué)事件。 綜上，本研究證實(shí)了RNF114作為一個(gè)E3泛素連接酶，通過對(duì)其下游底物的調(diào)控，在早期胚胎發(fā)育以及胚胎全能性維持上發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。通過對(duì)RNF114的生物學(xué)功能和機(jī)制的探索，為更加深入了解早期胚胎發(fā)育事件和調(diào)控機(jī)制奠定一定基礎(chǔ)，也為提高胚胎體外培養(yǎng)的成功率提供了一些新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R321

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本文編號(hào)：2418911