【摘要】：血吸蟲病(schistosomiasis)作為被忽視的熱帶病之一仍然嚴(yán)重危害人類健康,我國流行的是日本血吸蟲病(schistosomiasis japonica)。雖然50多年來我國血吸蟲病防治工作取得了巨大的進(jìn)展,但仍是我國重點(diǎn)防治的感染性疾病。肝脾腫大是慢性日本血吸蟲病的顯著特征之一,以往的研究集中于肝臟的病理損傷,而脾臟作為機(jī)體最大的外周免疫器官,其腫大的原因一度被歸結(jié)為門靜脈高壓,具體損傷機(jī)制并無系統(tǒng)研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲感染導(dǎo)致脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)破壞,淋巴細(xì)胞凋亡,本研究試圖進(jìn)一步尋找導(dǎo)致該現(xiàn)象的血吸蟲源分子,探討其致脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)破壞、淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制,并對日本血吸蟲感染晚期小鼠脾臟蟲卵肉芽腫同淋巴濾泡結(jié)構(gòu)重建現(xiàn)象之間的關(guān)系進(jìn)行了初步研究。 材料和方法 1.日本血吸蟲蟲卵對小鼠脾臟結(jié)構(gòu)的破壞 1.1感染血吸蟲不同時(shí)間小鼠脾臟蟲卵沉積情況觀察：C57BL/6雄性小鼠33只,每鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴20條。分別于感染后第5、7、9、16周隨機(jī)剖殺8-9只,取部分脾臟做石蠟切片,HE染色,顯微鏡下觀察脾臟內(nèi)蟲卵的分布狀況；其余脾臟研磨,計(jì)數(shù)脾臟蟲卵密度。同時(shí)取小鼠部分肝臟用4%KOH溶液消化,計(jì)算肝組織中的蟲卵密度。 1.2血吸蟲卵導(dǎo)致小鼠脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)破壞的觀察：C57BL/6雄性小鼠12只,隨機(jī)分為蟲卵尾靜脈注射組、可溶性蟲卵抗原(SEA)、可溶性成蟲抗原(SWA)尾靜脈注射組及脾臟手術(shù)注射蟲卵組,每組3只。注射用新鮮蟲卵調(diào)整至2500個(gè)/ml,尾靜脈注射0.1ml/鼠,每周注射一次,持續(xù)注射4周；SEA50μg/鼠,隔天注射一次,持續(xù)4周；脾臟蟲卵注射實(shí)驗(yàn)以手術(shù)方法打開小鼠腹腔,從脾臟下緣注入蟲卵懸液0.1ml,約含250個(gè)蟲卵。4周后剖殺各組小鼠,分離脾臟,固定后制作石蠟切片,HE染色觀察蟲卵對脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)影響。另外C57BL/6雄性小鼠20只,隨機(jī)分為單性感染組(9只)、雙性感染組(7只)和正常對照組(4只)。單性感染組以單只釘螺所逸得的尾蚴感染,剖殺時(shí)門靜脈灌注法收集成蟲觀察性別,觀察肝臟是否有蟲卵結(jié)節(jié)以排除雙性感染；雙性感染組以常規(guī)方法多只釘螺逸得的血吸蟲尾蚴感染,兩組小鼠感染尾蚴劑量均為每鼠20條；未處理鼠4只作為正常對照組。3組小鼠于感染后9周剖殺,稱量脾臟重量,石蠟切片觀察各組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)。 2.致小鼠脾臟T細(xì)胞凋亡的日本血吸蟲蟲卵蛋白分子量區(qū)段篩選 2.1血吸蟲感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察：C57BL/6雄性小鼠10只,每鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴20條。分別于感染后第5和第8周隨機(jī)剖殺,取脾臟制備單細(xì)胞懸液,即刻以熒光標(biāo)記的抗CD3、B220單抗及Annexin V標(biāo)記脾臟細(xì)胞中總的T、B細(xì)胞及凋亡細(xì)胞,并計(jì)算T、B細(xì)胞在總的脾細(xì)胞中比例以及凋亡的T、B細(xì)胞占各自總量的比例。取感染后8周小鼠脾臟,‘TUNEL法檢測有蟲卵沉積部位細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；蟲卵脾臟注射組小鼠手術(shù)后48h剖殺,TUNEL法檢測蟲卵注射部位細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。 2.2血吸蟲感染不同時(shí)間小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外在不同濃度SEA作用下凋亡的觀察：隨機(jī)分批感染小鼠,每組5只,每鼠經(jīng)腹部皮膚感染20條尾蚴,各組小鼠同時(shí)間剖殺以建立血吸蟲感染不同時(shí)間小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。取各組小鼠脾臟,制備單個(gè)淋巴細(xì)胞懸液,體外加入不同濃度SEA (15、30、60、120μg/ml)共培養(yǎng),TUNEL法檢測感染后不同時(shí)間(5、8、12、20周)脾臟總淋巴細(xì)胞細(xì)胞在不同濃度SEA刺激下凋亡情況。 2.3不同處理方式模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外在不同濃度SEA作用下凋亡的觀察：感染組、免疫組及正常對照各4只,感染組每鼠經(jīng)腹部皮膚感染20條尾蚴,感染后8w剖殺；免疫組小鼠50μg SEA在等體積完全弗氏佐劑中乳化混勻,背部多點(diǎn)注射小鼠1次,14d后剖殺,正常小鼠作為對照。取各組小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液,體外加入不同濃度SEA (40、80、120μg/ml)培養(yǎng)48h,Annexin V標(biāo)記不同組小鼠T、B細(xì)胞在不同濃度SEA刺激下凋亡情況。 2.4血吸蟲感染小鼠脾臟肉芽腫中T細(xì)胞分布觀察：取感染日本血吸蟲18周小鼠脾臟及肝臟,分別于固定后石蠟切片,免疫組化法比較脾臟及肝臟蟲卵肉芽腫中CD3+細(xì)胞分布。 2.5致小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡的SEA分子量區(qū)段篩選：制備SEA并即刻用16-60Superdex200層析柱按分子量將SEA進(jìn)行初步分離,按照出峰先后順序分離液收集為3個(gè)區(qū)段,分離液使用5kDa截留量超濾管濃縮,濾膜下方5kDa以下小分子物質(zhì)以冷凍干燥方法濃縮作為區(qū)段4。取SEA免疫小鼠脾臟細(xì)胞,尼龍毛柱法分離T細(xì)胞,與不同SEA區(qū)段共培養(yǎng)48h,4個(gè)區(qū)段抗原使用濃度均為100μg/ml, Annexin V標(biāo)記流式檢測、DNA ladder法、RT-PCR檢測T細(xì)胞中Fas、FasL mRNA水平等方法觀察各區(qū)段致T細(xì)胞凋亡情況,選取致凋亡作用最為顯著的蛋白區(qū)段進(jìn)一步將蛋白分為3個(gè)亞區(qū)段,多次電洗脫富集不同亞區(qū)段蛋白,同樣方法以60μg/ml的濃度同T細(xì)胞共培養(yǎng),Annexin V標(biāo)記流式檢測法將SEA中致凋亡蛋白分子量區(qū)間進(jìn)一步縮小。 3.日本血吸蟲感染晚期小鼠脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)重建的初步研究 C57BL/6小鼠30只,感染日本血吸蟲18周剖殺,按照脾臟表面有無蟲卵肉芽腫分為2組,即脾臟肉芽腫組和脾臟非肉芽腫組。石蠟切片HE染色觀察脾臟肉芽腫組脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)重建現(xiàn)象；ELISA法比較脾臟肉芽腫組及非肉芽腫組血清特異性抗體水平、淋巴細(xì)胞體外分泌細(xì)胞因子水平；免疫組化法觀察重建淋巴濾泡中B220+及CD3+淋巴細(xì)胞構(gòu)成,直接免疫熒光法觀察其PNA陽性生發(fā)中心有無,同時(shí)流式檢測組間CD4+T細(xì)胞中淋巴濾泡輔助性T細(xì)胞(Yfh)比例。 結(jié)果 1.日本血吸蟲蟲卵對小鼠脾臟結(jié)構(gòu)的破壞 1.1感染血吸蟲不同時(shí)間小鼠脾臟蟲卵沉積情況觀察：感染日本血吸蟲后5周,小鼠肝臟均檢測到少量蟲卵沉積,而脾臟此時(shí)并未檢測到蟲卵(0/8)。感染后7周,肝臟蟲卵數(shù)目猛增,脾臟也有蟲卵陽性出現(xiàn),并隨著感染進(jìn)程蟲卵出現(xiàn)在脾臟的頻率及數(shù)目都逐漸增加,感染后9周有蟲卵沉積于脾臟的小鼠已超過半數(shù)(6/8),提示日本血吸蟲感染小鼠模型中,蟲卵沉積于脾臟是非常普遍的現(xiàn)象。HE染色石蠟切片觀察脾臟中蟲卵時(shí)發(fā)現(xiàn)脾臟中蟲卵可以同在肝臟中一樣形成蟲卵肉芽腫,這種肉芽腫幾乎無一例外的出現(xiàn)在脾臟邊緣被膜部位,而沉積于脾臟髓質(zhì)區(qū)的蟲卵,即便是在感染后16周也并未形成蟲卵肉芽腫。 1.2血吸蟲卵導(dǎo)致小鼠脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)破壞的觀察：尾靜脈注射蟲卵及SEA、SWA4周后,同正常小鼠相比,蟲卵注射組小鼠脾臟淋巴濾泡數(shù)目減少,邊緣區(qū)模糊難辨,而SEA、SWA注射組同正常組小鼠相比脾臟結(jié)構(gòu)并無顯著區(qū)別。手術(shù)將蟲卵注射入小鼠脾臟4周后,蟲卵注射部位淋巴濾泡萎縮甚至消失。小鼠感染日本血吸蟲單性尾蚴后9周肝臟皆光滑無蟲卵結(jié)節(jié),對門靜脈灌注法收集到的成蟲觀察證實(shí)小鼠確為單一性別感染,表現(xiàn)為不能分辨性別的幼蟲或單性雄蟲。其中單性雄蟲長度大小與雙性尾蚴感染所得雄蟲相比幾乎無差別,但雙性尾蚴感染組脾腫大現(xiàn)象較正常及單性感染組嚴(yán)重得多,雙性尾蚴感染組(n=7,0.41g+0.03g)小鼠脾臟重量顯著高于正常對照組(n=4,0.07g±0.01g)(F=60.914, P0.001)及單性感染組(n=9,0.15g±0.01g)(P0.001)。HE染色脾臟切片顯示單性感染組小鼠脾臟淋巴濾泡未被破壞,雙性感染組脾臟淋巴濾泡消失。 2.致小鼠脾臟T細(xì)胞凋亡的日本血吸蟲蟲卵蛋白分子量區(qū)段篩選 2.1血吸蟲感染小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察：感染日本血吸蟲8周小鼠脾臟蟲卵肉芽腫中檢測到細(xì)胞凋亡,新鮮蟲卵注射入小鼠脾臟48h后蟲卵周圍同樣檢測到細(xì)胞凋亡且僅出現(xiàn)在蟲卵周圍。流式檢測結(jié)果顯示,同正常小鼠相比,感染日本血吸蟲后8周到脾臟T(F=11.143,P0.01)和B(F=33.789,P0.001)淋巴細(xì)胞數(shù)目都顯著下降；感染后8周小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡顯著(F=12.436,P0.01)高于正常組,而此時(shí)B細(xì)胞凋亡并不顯著(P0.05);感染后5周,不論是T、B細(xì)胞數(shù)目(P0.05)還是細(xì)胞凋亡率(P0.05)同正常組相比都無顯著差異；感染后8周T細(xì)胞凋亡率顯著高于B細(xì)胞(t=2.711,P0.01)。 2.2血吸蟲感染不同時(shí)間小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外在不同濃度SEA作用下凋亡的觀察：感染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(5、8、12、20周)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外在120μg/ml SEA濃度作用下細(xì)胞凋亡比例都高于60μg/ml,同樣濃度SEA作用下,感染后8周小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡最為顯著,120μg/ml濃度下細(xì)胞凋亡率達(dá)到55.77%,15、30μg/ml的SEA濃度上看不到細(xì)胞凋亡比例隨濃度增加而變化。 2.3不同處理方式模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體處在不同濃度SEA作用下凋亡的觀察：感染組、免疫組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外在遞增的SEA濃度作用下,表現(xiàn)出相似的趨勢,即T細(xì)胞凋亡率隨SEA濃度遞增而逐漸增加,120μg/ml濃度下細(xì)胞凋亡率顯著高于80μg/ml (F=0.139, P0.05; F=47.608, P0.001),但B細(xì)胞凋亡組間差異不大且無遞增趨勢,120μg/ml濃度下細(xì)胞凋亡率同80μg/ml相比無顯著差異(F=0.513,P0.05；F=26.490,P0.05)。正常組小鼠脾臟細(xì)胞體外SEA作用下細(xì)胞凋亡率相比前兩組無規(guī)律可循,同40μg/ml相比,T細(xì)胞在120μg/ml SEA作用下細(xì)胞凋亡并不顯著(P0.05)。 2.4血吸蟲感染小鼠脾臟肉芽腫中T細(xì)胞分布觀察：日本血吸蟲感染18周小鼠脾臟蟲卵肉芽腫中仍有大量CD3+淋巴細(xì)胞分布于蟲卵周圍,而同時(shí)間肝臟肉芽腫中卻無明顯T細(xì)胞分布。 2.5致小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡的SEA分子量區(qū)段篩選：SEA用16-60Superdex200層析柱及超濾管按分子量初步分離為4個(gè)分子區(qū)段,蛋白分別富集于Frl,55kDa; Fr2,30-70kDa; Fr3,5-30kDa; Fr4,5kDa。免疫小鼠脾臟T細(xì)胞體外加入100μg/ml的不同SEA區(qū)段分子,培養(yǎng)48h后,以Annexin V標(biāo)記流式檢測,DNA ladder法,RT-PCR檢測T細(xì)胞中Fas, FasL mRNA水平等方法檢測各區(qū)段刺激細(xì)胞凋亡水平,得出Frl蛋白組分致T細(xì)胞凋亡最為明顯,將SDS-PAGE上Frl分子進(jìn)一步電洗脫富集不同亞區(qū)段蛋白(Frl-1,Frl-2, Frl-3),以60μg/ml的濃度刺激T細(xì)胞48h,最終Annexin V法結(jié)果顯示Frl-2:55-72kDa亞蛋白區(qū)段致T細(xì)胞凋亡率達(dá)到57.04%,致凋亡結(jié)果最為顯著(P0.001)。 3.日本血吸蟲感染晚期小鼠脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)重建的初步研究 從小鼠感染日本血吸蟲8周開始,觀察到脾臟蟲卵肉芽腫現(xiàn)象,石蠟切片發(fā)現(xiàn)有蟲卵肉芽腫的脾臟隨著感染進(jìn)程,脾臟淋巴濾泡能夠恢復(fù)重建,而無蟲卵肉芽腫形成的脾臟無此現(xiàn)象。肉芽腫組小鼠雖然脾臟淋巴濾泡恢復(fù)重建,但重建的淋巴濾泡沒有明顯T細(xì)胞區(qū),也不能檢測到像感染5周小鼠脾臟切片上觀察到的PNA陽性的生發(fā)中心。感染18周小鼠脾臟肉芽腫組血清抗體IgG2a、IgG1、IgG及IgM水平皆高于脾臟非肉芽腫組,但除了IgG2a水平差異較為顯著(t=4.956,p0.05), IgG1、IgG及IgM抗體水平組間皆未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。體外SEA或ConA刺激下,2組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2及IFN-y水平組間差異不大,而脾臟肉芽腫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-4(F=25.119,p0.001)及IL-5(F=14.234, p0.001)細(xì)胞因子水平顯著高于非肉芽腫小鼠。而SEA刺激下,非肉芽腫組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IL-17的分泌顯著高于脾臟肉芽腫組(F=1.209,p0.05)。流式檢測卻發(fā)現(xiàn)脾臟肉芽腫組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中ICOS、CXCR5雙陽性的淋巴濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfh)比例高于非肉芽腫組。 結(jié)論 1.感染日本血吸蟲的C57BL/6小鼠隨著感染進(jìn)程脾臟中蟲卵沉積的數(shù)目和頻率都增加,日本血吸蟲蟲卵對脾臟淋巴濾泡結(jié)構(gòu)有破壞作用。 2.沉積于小鼠脾臟的日本血吸蟲蟲卵可能通過誘導(dǎo)脾臟細(xì)胞凋亡對脾臟造成損傷,高濃度的SEA體外誘導(dǎo)脾臟T細(xì)胞凋亡,其中55～72kDa蛋白區(qū)段致T細(xì)胞凋亡結(jié)果最為顯著。 3.日本血吸蟲感染小鼠破壞的淋巴濾泡結(jié)構(gòu)在感染晚期存在重建現(xiàn)象,初步發(fā)現(xiàn)脾臟蟲卵肉芽腫可能改變脾臟局部微環(huán)境,使其Th2反應(yīng)顯著,推測有利于脾臟淋巴濾泡重建。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2418458