【摘要】：目的：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transporters)是一組跨膜蛋白,以ATP為能源介導(dǎo)脂類(lèi)等多種分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。人類(lèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括A-G7個(gè)亞家族。ABCA6是ABCA亞家族成員,其表達(dá)調(diào)節(jié)和生物功能目前并不明確。我們通過(guò)生物芯片分析(microarray)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxO的人血管內(nèi)皮細(xì)胞中ABCA6的表達(dá)明顯上調(diào)。本研究著重探討FoxO調(diào)控ABCA6表達(dá)的分子機(jī)制,并對(duì)ABCA6的功能進(jìn)行了初步探索。 方法：分別用FoxO表達(dá)質(zhì)粒或FoxO SiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過(guò)real-time PCR檢測(cè)ABCA6mRNA表達(dá)的變化�？寺∪薃BCA6轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約800bp的啟動(dòng)子序列,構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒,將FoxO與ABCA6報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶的活性；構(gòu)建系列刪減或突變的報(bào)告基因質(zhì)粒,通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性的改變確定ABCA6啟動(dòng)子上FoxO的結(jié)合位點(diǎn)。為進(jìn)一步證實(shí)FoxO與ABCA6啟動(dòng)子的結(jié)合,我們通過(guò)EMSA觀察了在體外FoxO與ABCA6啟動(dòng)子的結(jié)合情況,并利用CHIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了在細(xì)胞內(nèi)FoxO與ABCA6啟動(dòng)子的結(jié)合。此外,我們通過(guò)Western Blot觀察了葡萄糖缺乏時(shí)細(xì)胞內(nèi)FoxO的表達(dá)變化,并用real-time PCR檢測(cè)了ABCA6mRNA的水平。為進(jìn)一步研究ABCA6的功能,我們構(gòu)建了ABCA6表達(dá)質(zhì)粒并建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ABCA6的細(xì)胞株,通過(guò)熒光免疫組化和共聚焦顯微鏡觀察ABCA6在胞內(nèi)定位,并用real-time PCR檢測(cè)了脂質(zhì)代謝相關(guān)基因Insigl表達(dá)的變化。 結(jié)果：在人血管內(nèi)皮細(xì)胞,過(guò)表達(dá)有自發(fā)活性的FoxO1TM, FoxO3TM引起ABCA6表達(dá)明顯上調(diào)；轉(zhuǎn)染FoxO1或FoxO3SiRNA導(dǎo)致ABCA6表達(dá)下降。用rVista工具對(duì)人ABCA6啟動(dòng)子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)有2個(gè)可被FoxO識(shí)別的結(jié)合序列。FoxO1、FoxO3和FoxO4均能明顯激活A(yù)BCA6啟動(dòng)子啟動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)；刪減或突變ABCA6啟動(dòng)子上任一結(jié)合位點(diǎn)則明顯抑制FoxO對(duì)ABCA6啟動(dòng)子的激活,提示FoxO激活A(yù)BCA6轉(zhuǎn)錄的效應(yīng)與上述2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。與之一致,EMSA結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)FoxO的核蛋白與ABCA6啟動(dòng)子發(fā)生明顯結(jié)合；CHIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性FoxO經(jīng)特異性抗體免疫沉淀后,可擴(kuò)增出包含F(xiàn)oxO結(jié)合位點(diǎn)的ABCA6啟動(dòng)子片段。我們還發(fā)現(xiàn),葡萄糖缺乏導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)FoxO表達(dá)明顯下降,此時(shí)ABCA6mRNA水平也明顯降低。此外,免疫組化染色及熒光共聚焦顯微鏡觀測(cè)顯示,ABCA6主要分布于細(xì)胞內(nèi)富含游離膽固醇的高爾基體；real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ABCA6的細(xì)胞中Insigl表達(dá)明顯下降。 結(jié)論：在人血管內(nèi)皮細(xì)胞中ABCA6的表達(dá)依賴于FoxO; FoxO能顯著激活A(yù)BCA6啟動(dòng)子;FoxO通過(guò)與ABCA6啟動(dòng)子上兩個(gè)位點(diǎn)的直接結(jié)合而調(diào)節(jié)ABCA6的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖缺乏時(shí),細(xì)胞內(nèi)FoxO表達(dá)明顯下降,ABCA6mRNA水平也明顯降低。ABCA6定位于細(xì)胞內(nèi)高爾基體,可能參與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。
[Abstract]:Aim: ABC transporter (ATP binding cassette transporters) is a group of transmembrane proteins. ATP is used as energy source to mediate the transmembrane transport of lipids and other molecules. Human ABC transporters include A-G7 subfamilies. ABCA6 is a member of ABCA subfamily, and its expression regulation and biological function are not clear. We found that the expression of ABCA6 was up-regulated in human vascular endothelial cells overexpression of transcription factor FoxO by biochip (microarray) analysis. This study focuses on the molecular mechanism of ABCA6 expression regulated by FoxO and the function of ABCA6. Methods: FoxO expression plasmid or FoxO SiRNA were used to transfect the cells, and real-time PCR was used to detect the changes of ABCA6mRNA expression. The promoter sequence of human ABCA6 transcription initiation site was cloned and the reporter gene plasmid was constructed. The FoxO and ABCA6 reporter gene plasmids were co-transfected to detect the luciferase activity. A series of reporter gene plasmids with deletion or mutation were constructed and the binding sites of FoxO on ABCA6 promoter were determined by determining the changes of luciferase activity. In order to further confirm the binding of FoxO to ABCA6 promoter, we observed the binding of FoxO to ABCA6 promoter in vitro by EMSA, and detected the binding of FoxO to ABCA6 promoter by CHIP assay. In addition, we observed the expression of FoxO in glucose deficient cells by Western Blot and detected the level of ABCA6mRNA by real-time PCR. In order to further study the function of ABCA6, we constructed a ABCA6 expression plasmid and established a cell line stably transfected with ABCA6. The localization of ABCA6 in cells was observed by fluorescence immunohistochemistry and confocal microscopy. The changes of Insigl expression of lipid metabolism related genes were detected by real-time PCR. Results: in human vascular endothelial cells, overexpression of spontaneous FoxO1TM, FoxO3TM resulted in a significant up-regulation of ABCA6 expression, while transfection of FoxO1 or FoxO3SiRNA led to a decrease in ABCA6 expression. RVista analysis of human ABCA6 promoter showed that there were two binding sequences recognized by FoxO. Both FoxO1,FoxO3 and FoxO4 could significantly activate the expression of luciferase reporter gene initiated by ABCA6 promoter. Deletion or mutation of ABCA6 promoter at one binding site significantly inhibited the activation of ABCA6 promoter by FoxO, suggesting that the effect of FoxO on ABCA6 transcription was related to the two binding sites mentioned above. In line with the EMSA results, the nucleoprotein overexpression of FoxO was significantly associated with the ABCA6 promoter, and CHIP assay showed that the ABCA6 promoter fragment containing FoxO binding sites could be amplified by specific antibody immunoprecipitation of endogenous FoxO. We also found that glucose deficiency resulted in a significant decrease in FoxO expression and a significant decrease in ABCA6mRNA levels. In addition, immunohistochemical staining and fluorescence confocal microscopy showed that ABCA6 was mainly distributed in Golgi body, which was rich in free cholesterol, and the expression of Insigl in stable transfected ABCA6 cells was significantly decreased by real-time PCR assay. Conclusion: the expression of ABCA6 in human vascular endothelial cells depends on the activation of ABCA6 promoter by FoxO; FoxO, and FoxO regulates the transcription of ABCA6 by directly binding to two sites of ABCA6 promoter. When glucose was deficient, the expression of FoxO and the level of ABCA6mRNA decreased significantly. ABCA6 was located in Golgi body and might be involved in the transport and metabolism of cholesterol.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R364

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本文編號(hào)：2416473