【摘要】：一、研究目的和意義 人樹突狀細(xì)胞(hDCs)是專職的抗原提呈細(xì)胞,通過其表面的MHC類分子與肽類抗原結(jié)合,將抗原呈遞給T細(xì)胞,促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖,另外,還可促進(jìn)B細(xì)胞的活化和調(diào)節(jié)體液免疫。成熟DC的表面高表達(dá)MHC類分子、黏附分子、細(xì)胞因子(如IL-12)等的分泌,很大程度上促進(jìn)了機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng),DC的這種特性被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤免疫治療和抗感染治療等。以DC成熟為基礎(chǔ)的免疫應(yīng)答雖然能有效的突破細(xì)胞水平的自身免疫耐受并活化自身抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,卻很少引起抗瘤和正常組織的自身免疫病理反應(yīng),高親和性自身抗原肽、促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟及TLR效應(yīng)劑活化高效的自身反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)卻并不足以打破屬主的自身耐受誘導(dǎo)自身抗腫瘤免疫病理。說明突破細(xì)胞水平(自身反應(yīng)性CTL活化)及宿主水平(自身免疫病理)的自身耐受條件是不同的,即使在炎癥刺激持續(xù)存在的條件下,強(qiáng)有力的信號抑制子也能有效阻止DC過度活化自身反應(yīng)性CTL引起自身免疫病理,在自然狀態(tài)抑制機(jī)體免疫的條件下宿主水平的自身免疫耐受依然存在,并可能由各種機(jī)制持續(xù)促進(jìn),例如,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及腫瘤的各種誘導(dǎo)因子等,這樣就阻礙了以DC為基礎(chǔ)的瘤苗的效率及運(yùn)用。Gilboa E等已經(jīng)證明鼠的樹突狀細(xì)胞可以誘導(dǎo)有效的抗腫瘤應(yīng)答,但是目前針對腫瘤患者的DC疫苗的試驗(yàn)客觀臨床反應(yīng)率很低,結(jié)果令人不滿意。所以找到針對腫瘤抗原可以誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答的途徑是DC疫苗的一大挑戰(zhàn)。 SOCS家族通過JAK-STAT (Janus kinase signal transduction and activators of transcription)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌,SOCS家族由SOCS1-SOCS7及CIS (cytokine-inducible SH2-containing protein)8個成員組成,它們共同擁有一個中央SH2域和高度保守的羧基端SOCS盒。SOCS1是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子,SOCS1的調(diào)節(jié)功能的分子機(jī)制是利用基因敲除鼠和基因沉默技術(shù)逐步發(fā)現(xiàn)的。作為負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子之一,SOCS1通過直接抑制JAK酪氨酸激酶和活性細(xì)胞因子的級聯(lián)信號來下調(diào)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)。同時,某些研究發(fā)現(xiàn)SOCS1還可以通過直接或間接的機(jī)制下調(diào)TLR(Toll-like receptor, Toll樣受體)信號傳導(dǎo)通路。細(xì)胞因子受體傳導(dǎo)通路和TLR信號傳導(dǎo)通路對許多種類的細(xì)胞的生存、成熟和分化和免疫功能等重要功能都起著重要的調(diào)節(jié)作用。SOCS1已經(jīng)在多種人類惡性腫瘤細(xì)胞中被檢測出異常表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致了細(xì)胞因子受體和TLR受體促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)異常。SOCS1還被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞的致癌作用有關(guān)。對于抗原提呈細(xì)胞(antigens presenting cells, APCs)來說,SOCS1被大家認(rèn)為是經(jīng)典的抗原提呈衰減子,SOCS1負(fù)性調(diào)節(jié)APC分泌的細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo),以此來影響微環(huán)境中APCs和T細(xì)胞的功能和分化。SOCS1通過負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控許多細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo),如IFN-Υ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21等。而這些細(xì)胞因子對人體的免疫應(yīng)答起著至關(guān)重要的作用,例如IL-2促進(jìn)CD4＋T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生,IL-7對CD8＋T淋巴細(xì)胞的存活和維持CD4＋T淋巴細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著重要作用,IL-12通過增加CD8＋T淋巴細(xì)胞對IL-7、IL-15的敏感性來調(diào)控CD8＋T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答效應(yīng)等等。SOCS1還通過一些機(jī)制直接影響T細(xì)胞的的分化、成熟和功能。正因?yàn)樵诿庖哒{(diào)節(jié)機(jī)制方面的重要地位,SOCS1已經(jīng)在某些免疫相關(guān)疾病中得到廣泛研究,如惡性腫瘤、HIV感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)等等。因此通過沉默SOCS1導(dǎo)致抗原呈遞DCs的IL-12信號和下游細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)不受約束,從而導(dǎo)致宿主水平自身耐受的打破,有望成為腫瘤疫苗治療的新方向。Hong B等已經(jīng)通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默樹突狀細(xì)胞SOCS1基因可以增強(qiáng)特異性抗腫瘤免疫。因此,我們希望利用構(gòu)建慢病毒載體SOCS1基因siRNA,抑制樹突狀細(xì)胞中SOCS1基因的表達(dá),為下一步研究沉默樹突狀細(xì)胞SOCS1基因的DC疫苗提供一種技術(shù)方法。目前已有化學(xué)合成方法制備小干擾RNA(siRNA)抑制人樹突狀細(xì)胞SOCS1基因,從而進(jìn)一步研究hDC免疫功能改變,但siRNA不穩(wěn)定,抑制時間較短,抑制效率較低,本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒,長時間抑制SOCS1基因,且抑制效率較高,為進(jìn)一步研究DC增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。 二、方法 1.人SOCS1寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成查閱與本課題類似的相關(guān)文獻(xiàn),據(jù)其篩選出一條序列作為RNAi靶點(diǎn),送吉瑪公司設(shè)計(jì)、合成寡核苷酸鏈,其中正義鏈的5’末端引入Bbs I酶切位點(diǎn),反義鏈的5’末端引入Xho I酶切位點(diǎn)。序列如下：SOCS15'-CACGCACTTCCGCACATTC-3';設(shè)計(jì)陰性對照為Negative:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。 2.人SOCS1siRNA表達(dá)重組體的構(gòu)建將合成的寡核苷酸鏈5’端磷酸化,退火形成具有Bbs I、Xho I酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA,與已經(jīng)進(jìn)行過酶切處理的慢病毒載體LV1連接,構(gòu)建人SOCS1siRNA慢病毒干擾載體質(zhì)粒。利用感受態(tài)的大腸桿菌DH5a轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒,PCR擴(kuò)增進(jìn)行初步鑒定,然后用質(zhì)粒試劑盒抽提質(zhì)粒,并通過DNA測序進(jìn)一步鑒定。 3.病毒生產(chǎn)及包裝正常培養(yǎng)293T細(xì)胞,在感染前一天接種到培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。SOCS1-siRNA慢病毒包裝復(fù)合物共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM在轉(zhuǎn)染后24h換液；轉(zhuǎn)染后48h,收集細(xì)胞上清,5000r/min離心5min,然后使用0.45μm的聚偏氟乙烯膜過濾上清液,放在-80℃冰箱保存。 4.病毒的滴度測定正常培養(yǎng)293T細(xì)胞,在感染前一天接種到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。使用已經(jīng)生產(chǎn)好的病毒液感染293T細(xì)胞,72h后用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞,結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。 5.DC培養(yǎng)抽取健康成年志愿者外周血經(jīng)等量生理鹽水稀釋后Ficoll分離,收集淋巴細(xì)胞,以AIM-V為培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105/ml,培養(yǎng)于6孔板,每孔3m1,在37℃、5%C02孵箱中培養(yǎng)貼壁5h后輕輕洗去懸浮的淋巴細(xì)胞,每孔加3m1含GM-CSF(終濃度為800U/m1)的AIM-V培養(yǎng)基。隔天換液,每孔加入3ml含GM-CSF(終濃度為800U/m1)、IL-4(終濃度為800U/m1)的AIM-V培養(yǎng)基。第5天,除了GM-CSF和IL-4外,還加入TNF-α(終濃度為20ng/m1)。第7天,收集DC,光學(xué)顯微鏡下觀察DC形態(tài)。 6.基因轉(zhuǎn)染DC培養(yǎng)第3天進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)共分為3組：(1)空白細(xì)胞組；(2)siRNA-Negative組；(3)siRNA組。其中空白細(xì)胞組作為對照組,用于檢測樹突狀細(xì)胞中SOCS1基因的本底表達(dá)量；siRNA-Negative組用于檢測陰性序列質(zhì)粒本身轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中是否影響SOCS1基因的表達(dá)量。6孔板每組2孔,干擾組每孔分別加入40μ1稀釋至106病毒液及終濃度為5μg/ml的Polybrene,陰性對照組加入對照病毒液40μ1及終濃度為5μg/ml的Polybrene,空白對照組加入相同量的AIM-V培養(yǎng)基,每孔加入960μ1含GM-CSF(終濃度為800U/m1)及IL-4(終濃度為800U/m1)的AIM-V培養(yǎng)基。培養(yǎng)12h后換液,每孔加3m1含GM-CSF(終濃度為800U/m1)及IL-4(終濃度為800U/m1)的AIM-V培養(yǎng)基。然后隔天換液。 7.實(shí)時熒光定量PCR檢測SOCS1mRNA的表達(dá)DCs慢病毒干擾96h后利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后樹突狀細(xì)胞的熒光表達(dá)情況。 8.Western blot檢測DCs細(xì)胞SOCS1蛋白的表達(dá)siRNA干擾96小時后分別收集三組hDCs, RIPA全細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。各取30μg上述蛋白樣品進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗SOCS1抗體4℃孵育、TBST洗膜3次、HRP標(biāo)記的二抗作用、再次TBST洗膜3次后化學(xué)發(fā)光法顯影,X光片曝光顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理我們利用SPSS13.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示。RT-PCR和Western Blot的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用方差分析(one-way AN OVA)比較各個實(shí)驗(yàn)組之間的差異,設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。 三、結(jié)果 1.DC形態(tài)學(xué)觀察光學(xué)顯微鏡下可見,培養(yǎng)7天中,從外周血分離獲得的大量成熟DC細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)不一,長短不一的樹突狀突起逐漸長出,各個DC細(xì)胞之間構(gòu)成集落。 2.熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率SOCS1siRNA慢病毒載體感染樹突狀細(xì)胞48h、96h后分別用熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率。96h后染上綠色熒光樹突狀細(xì)胞較48h明顯增多,肉眼所見染色細(xì)胞在70%以上,初步表明慢病毒載體構(gòu)建成功。 3.RT-PCR檢測hDCs SOCS1mRNA表達(dá)情況實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示,與空白細(xì)胞組及陰性對照組比較,siRNA組mRNA表達(dá)量下調(diào)達(dá)72%。SOCS1基因和GAPDH基因PCR產(chǎn)物的融解曲線,證實(shí)PCR產(chǎn)物為特異擴(kuò)增產(chǎn)物,用其定量準(zhǔn)確可信。 4.Western blot檢測DCs SOCS1蛋白的表達(dá)情況Western blot檢測與空白細(xì)胞組及陰性對照組相比,siRNA組SOCS1蛋白的表達(dá)顯著降低(P0.05) 四、結(jié)論 我們利用慢病毒載體構(gòu)建的SOCS1基因siRNA可以成功轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞,siRNA干擾細(xì)胞較正常細(xì)胞比,SOCS1的表達(dá)明顯降低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2410769