【摘要】：目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一類具有向神經(jīng)細(xì)胞分化能力的多潛能干細(xì)胞,可應(yīng)用于神經(jīng)功能缺損的細(xì)胞移植治療。本實(shí)驗(yàn)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的特點(diǎn),旨在培養(yǎng)出高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。探討大鼠腦組織勻漿上清液對BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響,在以堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)液中分別加入正常和損傷大鼠腦組織勻漿上清液,觀察各組神元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)后細(xì)胞活力的差異。 方法:無菌條件下取大鼠股骨和脛骨骨髓,采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和傳代,選取第3代、第5代和第7代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板,連續(xù)10天每天同一時(shí)間計(jì)數(shù)各代的細(xì)胞數(shù),繪制細(xì)胞生長曲線圖。采用流式細(xì)胞儀檢測第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面的CD29,CD44和CD45抗原的表達(dá)。取第4代的BMSCs,按105/ml濃度接種于6孔板和96孔板內(nèi),以1mmol /L濃度BME和含20%血清的DMEM培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24 h后,分別加入bFGF 20ng/ml、bFGF 20ng/ml+正常大鼠腦勻漿上清100ul/ml、bFGF 20ng/ml+損傷大鼠腦勻漿上清100ul/ml,誘導(dǎo)至細(xì)胞分化,另留取空白對照組不加任何誘導(dǎo)劑。細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)過程中每天在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察其形態(tài)變化。取6孔板內(nèi)各組誘導(dǎo)后48h的細(xì)胞進(jìn)行爬片,采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法分別檢測各組誘導(dǎo)分化后細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neural-specific enolase, NSE)、微管相關(guān)蛋白-2(Microtubule associated protein 2, MAP-2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表達(dá),計(jì)算出誘導(dǎo)陽性率。取96孔板內(nèi)誘導(dǎo)后的細(xì)胞用MTT法檢測各組誘導(dǎo)后5h、24h、48h、3d、5d誘導(dǎo)后細(xì)胞的生長狀況。 結(jié)果:倒置顯微鏡下觀察可見培養(yǎng)24h后部分細(xì)胞貼壁呈多角形,72h后貼壁細(xì)胞增大、分裂增殖,2周左右細(xì)胞匯合至70%～80%,此時(shí)可傳代。傳代24 h后BMSCs即可貼壁生長,約5 d～7 d可鋪滿瓶。此后隨著換液、傳代,細(xì)胞逐漸表現(xiàn)為排列旋渦狀、菊花狀的均一梭形。第3、5、7代細(xì)胞生長曲線測定顯示這3代細(xì)胞具有相同的生長特性,表現(xiàn)為傳代后約兩天為潛伏期,細(xì)胞生長緩慢,第3天進(jìn)入指數(shù)生長期,這一時(shí)期持續(xù)到第8天,此后進(jìn)入平臺期;隨著傳代次數(shù)的增多,細(xì)胞增殖速度有減弱趨勢。流式細(xì)胞術(shù)檢測第4代BMSCs結(jié)果為CD29、CD44和CD34的表達(dá)率為99.8%、99.7 %和2.2%。BMSCs預(yù)誘導(dǎo)24h,可見少量細(xì)胞逐漸向胞核方向收縮,加入各誘導(dǎo)劑后上述變化增多,有突起形成并隨時(shí)間增長,部分視野可見突起交織成網(wǎng)狀,對照組細(xì)胞形態(tài)無變化。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見各誘導(dǎo)組細(xì)胞均有部分細(xì)胞NSE和MAP-2陽性,GFAP陰性。對照組均不表達(dá)NSE、MAP-2和GFAP。計(jì)算各組細(xì)胞的誘導(dǎo)陽性率為:bFGF誘導(dǎo)組NSE的表達(dá)率為44.50%,MAP-2的表達(dá)率為45.70%;正常大鼠腦組織勻漿上清誘導(dǎo)組NSE的表達(dá)率為63.10%,MAP-2的表達(dá)率為65.30%;損傷大鼠腦組織勻漿上清誘導(dǎo)組NSE的表達(dá)率為73.30%,MAP-2的表達(dá)率為75.60%。MTT結(jié)果顯示加入腦組織勻漿上清的細(xì)胞生長狀況好于對照組,其中損傷勻漿組的細(xì)胞活力更好。 結(jié)論采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可以培養(yǎng)出高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,第3、5、7代細(xì)胞的生長特性基本相同,傳代后均經(jīng)歷潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期,隨著傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞增殖有減弱的趨勢。大鼠腦組織勻漿上清液能提高其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向的分化的陽性率和誘導(dǎo)后細(xì)胞的活力。相比于正常腦組織勻漿,損傷勻漿的作用更強(qiáng)。
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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2410716