【摘要】：【目的】 腫瘤基因治療的關鍵是載體的選擇,慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒(HIV)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體,它對分裂期細胞和非分裂期細胞均具有感染能力,能夠整合到宿主細胞的基因組中,可以在體內長期穩(wěn)定表達,還具有容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等優(yōu)點。本研究采用慢病毒作為載體,構建小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體,鑒定其在293T細胞中的表達,為雙基因治療淋巴瘤的實驗研究奠定基礎。 【方法】 1.第一部分,自行設計引物合成小鼠MIP-1α和B7-1基因的全長編碼序列cDNA,采用巢式PCR擴增目的基因,使用Age I酶對慢病毒載體進行酶切消化,將目的基因與經酶切線性化的慢病毒載體進行定向連接,其產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,對長出的陽性克隆進行PCR鑒定和直接測序序列分析,測序結果與目標基因序列完全一致的即為構建成功的目的基因質粒。然后將構建好的目的基因質粒進行超純去內毒素抽提。 2.第二部分,MIP-1α和B7-1目的基因質粒分別轉染293T細胞,48小時后,觀察熒光報告基因的綠色熒光蛋白(GFP)表達,并采用Western Blot法檢測目的基因質粒在293T細胞中的表達。 3.第三部分,采用pGC-LV重組慢病毒載體和包裝質粒pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體組成的三質粒系統(tǒng),共轉染293T細胞,培養(yǎng)48 h后,收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,對其濃縮和純化得到高滴度的慢病毒濃縮液。取10μl慢病毒濃縮液轉染293T細胞,提取總RNA,逆轉錄獲得cDNA,應用實時熒光定量PCR檢測慢病毒濃縮液的滴度。 【結果】 1.成功構建小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體,目的基因測序結果與目標序列完全一致。 2. MIP-1α和B7-1目的基因質粒轉染293T細胞后,均可觀察到熒光報告基因的綠色熒光蛋白表達,Western Blot法成功檢測到MIP-1α、B7-1目的基因質粒在293T細胞中表達。 3.三質粒系統(tǒng)成功共轉染293T細胞,包裝出高滴度的MIP-1α、B7-1基因重組慢病毒濃縮液,實時熒光定量PCR證實MIP-1α、B7-1基因重組慢病毒載體的滴度均達2.00E+8 TU/ml。 【結論】 本研究成功構建并包裝出高滴度的小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體,為淋巴瘤雙基因治療的實驗研究奠定了基礎。
[Abstract]:[objective] the key of tumor gene therapy is the selection of vector. Lentivirus vector is a gene therapy vector developed on the basis of human immunodeficiency virus (HIV). It has the ability to infect both mitotic and non-mitotic cells. It can be integrated into the genome of host cells and can be expressed stably in vivo for a long time. It also has the advantages of containing large foreign target gene fragments and small immune response. In this study, the recombinant lentivirus vector of mouse chemokine MIP-1 偽 and costimulatory molecule B7-1 was constructed by using lentivirus as a vector, and its expression in 293T cells was identified, which laid a foundation for the experimental study of double gene therapy for lymphoma. [methods] 1. In the first part, the full-length encoding sequence cDNA, of mouse MIP-1 偽 and B7-1 genes was synthesized by using self-designed primers. The target gene was amplified by nested PCR, and the lentivirus vector was digested by Age I enzyme. The target gene was directly ligated with the lentivirus vector which was linearized by enzyme digestion, and its product was transformed into E. coli DH5 偽 competent cells. The positive clones were identified by PCR and sequenced directly. The result of sequencing is consistent with the target gene sequence, that is, the successful construction of the target gene plasmid. Then the constructed target gene plasmid was extracted by ultrapure endotoxin removal. 2. In the second part, MIP-1 偽 and B7-1 target gene plasmids were transfected into 293T cells respectively. After 48 hours, the expression of green fluorescent protein (GFP) of fluorescent reporter gene was observed, and the expression of the target gene plasmid in 293T cells was detected by Western Blot method. 3. In the third part, pGC-LV recombinant lentivirus vector, packaging plasmid pHelper 1.0 vector and pHelper 2.0 vector were used to co-transfect 293T cells. After 48 hours of culture, supernatants containing lentivirus particles were collected. Concentrated and purified lentivirus concentrate with high titer was obtained. 10 渭 l lentivirus concentrate was transfected into 293T cells, and total RNA, was extracted by reverse transcription to obtain cDNA,. The titer of lentivirus concentrate was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. [result] 1. The recombinant lentivirus vector of mouse chemokine MIP-1 偽 and costimulatory molecule B7-1 was successfully constructed. 2. After transfection of MIP-1 偽 and B7-1 target gene plasmids into 293T cells, the expression of MIP-1 偽 and B7-1 target gene plasmids in 293T cells were successfully detected by, Western Blot. 3. The three plasmids were successfully cotransfected into 293T cells and packaged with high titer of MIP-1 偽 and B7-1 recombinant lentivirus concentrate. Real-time quantitative PCR confirmed that MIP-1 偽 and B7-1 recombinant lentivirus vectors all had the titer of 2.00E8 TU/ml.. [conclusion] the recombinant lentivirus vector with high titer of mouse chemokine MIP-1 偽 and costimulatory molecule B7-1 was successfully constructed and packaged in this study, which laid a foundation for the experimental study of double gene therapy for lymphoma.
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 馬強;李明;董文其;吳英松;;一種新型慢病毒載體制備體系的初步建立[J];生物化學與生物物理進展;2007年08期

2 韓濤;郜金榮;吳正輝;李惠平;葉林柏;;艾滋病的基因治療策略及慢病毒載體[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2007年03期

3 馬強;李明;董文其;吳英松;;一種新型慢病毒載體制備方法的建立[J];生物工程學報;2007年05期

4 王峰;陳琳;邵建國;;慢病毒綠色熒光蛋白感染人胰腺癌細胞株CFPAC-1的效率觀察[J];南通大學學報(醫(yī)學版);2008年01期

5 竇立萍;達萬明;王暢;康慧媛;趙瑜;孫敬芬;靳海杰;王全順;高春記;于力;;Kir2ds4基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J];中國實驗血液學雜志;2008年03期

6 焦伊勝;王永來;張淑蘭;王桂玲;;凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒載體的構建與鑒定[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2008年24期

7 周磊;陳婕;徐欣;張敏;張新;;利用重組慢病毒載體建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白細胞系[J];中國臨床醫(yī)學;2009年02期

8 張樂;官國先;;SATB1基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J];中國實用醫(yī)藥;2009年14期

9 羅毅;王小聰;鄒萍;;Pir-b基因慢病毒載體的構建和表達[J];中國實驗血液學雜志;2009年04期

10 李軍;余松濤;司維柯;李招權;潘靜;趙宸;趙辰;;hTERT基因啟動子驅動eGFP的慢病毒載體構建及表達的初步研究[J];重慶醫(yī)學;2009年18期

相關會議論文 前10條

1 王海彬;;雌激素相關受體α基因超表達慢病毒載體的構建[A];中華醫(yī)學會第六次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨中華醫(yī)學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會成立十周年論文匯編[C];2011年

2 高書穎;于潔;;攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體的構建及鑒定[A];“細胞活動 生命活力”——中國細胞生物學學會全體會員代表大會暨第十二次學術大會論文摘要集[C];2011年

3 蔡偉光;丁景華;習欠云;肖敏;江青艷;吳珍芳;張永亮;;慢病毒與精子孵育法介導轉基因豬的制備[A];全國動物生理生化第十一次學術交流會論文摘要匯編[C];2010年

4 王筠;李澎濤;;腦微血管內皮細胞對MIP-1β誘導大鼠小膠質細胞遷移的影響[A];中國病理生理學會第九屆全國代表大會及學術會議論文摘要[C];2010年

5 于潔;高書穎;;攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體的構建[A];中國的遺傳學研究——遺傳學進步推動中國西部經濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2011年

6 徐敏;楊曉紅;陳龍;葉靜;李么明;陳煥春;曹勝波;;慢病毒載體介導表達西尼羅河病毒prME蛋白[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會第二次學術研討會論文集[C];2010年

7 劉峰;肖興鵬;田玉科;;大鼠蛋白激酶Cγ可控shRNA慢病毒的構建與鑒定[A];2011年全國醫(yī)藥學術論壇交流會暨臨床藥學與藥學服務研究進展培訓班論文集[C];2011年

8 宋喜;張克讓;;慢病毒介導的過表達GSK3β小鼠與抑郁障礙發(fā)生的研究[A];中華醫(yī)學會精神病學分會第九次全國學術會議論文集[C];2011年

9 劉競;余鋒;桂嶸;李昕;蔣鐵斌;王二華;李穎;王成紅;唐雪元;陳方平;;Survivin shRNA慢病毒載體構建[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

10 于福先;潘建治;朱志偉;陳曉宇;;豬白介素1 5(IL-1 5)基因克隆及其慢病毒載體的構建[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術研討會論文集（上冊）[C];2010年

相關重要報紙文章 前8條

1 辛紫;中國倆科學家創(chuàng)新項目入選[N];醫(yī)藥經濟報;2009年

2 本報記者 鄭靈巧;十萬美元驗證一個新點子[N];健康報;2009年

3 張?zhí)锟?基因療法:沉寂之后的復蘇?[N];南方周末;2009年

4 記者 任海軍;基因療法卷土重來 人類頑疾有望治愈[N];經濟參考報;2010年

5 記者 徐亞靜;抑制VCAM——1表達可減少頸動脈術后再狹窄[N];中國醫(yī)藥報;2010年

6 記者 師巧梅;我區(qū)綿羊轉基因研究取得重大突破[N];新疆日報(漢);2010年

7 記者 王菲 胡江;新疆科學家“破解”綿羊轉基因技術“密碼”[N];新疆科技報(漢);2010年

8 記者 王小龍;人造病毒可給艾滋病病毒定位[N];科技日報;2011年

相關博士學位論文 前10條

1 韋燁;基因改造骨髓造血干細胞靶向抑制結直腸癌新生血管形成的實驗研究[D];復旦大學;2010年

2 俞曉嵐;過表達CXCR4的骨髓間質干細胞移植治療大鼠腦梗死的療效觀察[D];福建醫(yī)科大學;2010年

3 劉瑜;BTBD10在人腦膠質瘤中的表達及其對U251細胞株增殖和凋亡的影響[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

4 林恒;線粒體轉錄因子A在重組人肝再生增強因子對梗阻性黃疸大鼠肝功能保護中的作用機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2009年

5 林文平;腦紅蛋白基因修飾的骨髓間充質干細胞對兔脊髓損傷保護作用的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2011年

6 王鵬;依賴p53的癌基因Wip1在人腦膠質瘤細胞惡性增殖機制中的作用研究[D];華中科技大學;2010年

7 呂學軍;Caveolin-1在LPS誘導AT-1細胞和小鼠肺部急性損傷中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2010年

8 蘇冠華;肝細胞生長因子基因修飾的骨髓間充質干細胞移植的促血管新生作用[D];華中科技大學;2010年

9 楊志峰;應用慢病毒載體介導RNA干擾在MCF-7細胞中剔降IKKα基因和制備轉基因小鼠模型的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

10 陳柏齡;慢病毒載體介導血管生成素-1基因修飾的骨髓間充質干細胞移植治療腦梗死的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 劉偉;小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體的構建及鑒定[D];福建醫(yī)科大學;2011年

2 馬貴亮;慢病毒載體介導的TNF-α基因在臍血間充質干細胞中的表達的實驗研究[D];青島大學;2010年

3 欒沖;可誘導表達hBMP-2基因的慢病毒載體的構建及其慢病毒的產生和鑒定[D];青島大學;2010年

4 陳豪;乙肝病毒X基因（HBVX）慢病毒載體的構建和鑒定[D];福建醫(yī)科大學;2011年

5 陳春;攜帶大鼠Foxp3基因慢病毒載體的構建及慢病毒包裝的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2011年

6 沈上杭;短發(fā)夾RNA抑制缺氧誘導因子-1α表達對腦膠質瘤細胞增殖、侵襲及轉移的影響[D];福建醫(yī)科大學;2010年

7 盛鵬程;綿羊Myostatin基因shRNA慢病毒載體的構建與鑒定[D];山東農業(yè)大學;2011年

8 魏衍全;慢病毒介導shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制口蹄疫病毒增殖的兩類細胞系的建立[D];中國農業(yè)科學院;2011年

9 張曉宇;含LfcinB基因慢病毒載體的構建及體外對SKOV3細胞作用的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2011年

10 張國峰;慢病毒載體介導的RNAi抑制牛整聯(lián)蛋白亞基αv基因表達的研究[D];中國農業(yè)科學院;2011年

，

本文編號：2407910