【摘要】：【目的】 腫瘤基因治療的關(guān)鍵是載體的選擇,慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,它對分裂期細胞和非分裂期細胞均具有感染能力,能夠整合到宿主細胞的基因組中,可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達,還具有容納外源性目的基因片段大、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點。本研究采用慢病毒作為載體,構(gòu)建小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體,鑒定其在293T細胞中的表達,為雙基因治療淋巴瘤的實驗研究奠定基礎(chǔ)。 【方法】 1.第一部分,自行設(shè)計引物合成小鼠MIP-1α和B7-1基因的全長編碼序列cDNA,采用巢式PCR擴增目的基因,使用Age I酶對慢病毒載體進行酶切消化,將目的基因與經(jīng)酶切線性化的慢病毒載體進行定向連接,其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,對長出的陽性克隆進行PCR鑒定和直接測序序列分析,測序結(jié)果與目標基因序列完全一致的即為構(gòu)建成功的目的基因質(zhì)粒。然后將構(gòu)建好的目的基因質(zhì)粒進行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。 2.第二部分,MIP-1α和B7-1目的基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞,48小時后,觀察熒光報告基因的綠色熒光蛋白(GFP)表達,并采用Western Blot法檢測目的基因質(zhì)粒在293T細胞中的表達。 3.第三部分,采用pGC-LV重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體組成的三質(zhì)粒系統(tǒng),共轉(zhuǎn)染293T細胞,培養(yǎng)48 h后,收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液,對其濃縮和純化得到高滴度的慢病毒濃縮液。取10μl慢病毒濃縮液轉(zhuǎn)染293T細胞,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測慢病毒濃縮液的滴度。 【結(jié)果】 1.成功構(gòu)建小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體,目的基因測序結(jié)果與目標序列完全一致。 2. MIP-1α和B7-1目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后,均可觀察到熒光報告基因的綠色熒光蛋白表達,Western Blot法成功檢測到MIP-1α、B7-1目的基因質(zhì)粒在293T細胞中表達。 3.三質(zhì)粒系統(tǒng)成功共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝出高滴度的MIP-1α、B7-1基因重組慢病毒濃縮液,實時熒光定量PCR證實MIP-1α、B7-1基因重組慢病毒載體的滴度均達2.00E+8 TU/ml。 【結(jié)論】 本研究成功構(gòu)建并包裝出高滴度的小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體,為淋巴瘤雙基因治療的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:[objective] the key of tumor gene therapy is the selection of vector. Lentivirus vector is a gene therapy vector developed on the basis of human immunodeficiency virus (HIV). It has the ability to infect both mitotic and non-mitotic cells. It can be integrated into the genome of host cells and can be expressed stably in vivo for a long time. It also has the advantages of containing large foreign target gene fragments and small immune response. In this study, the recombinant lentivirus vector of mouse chemokine MIP-1 偽 and costimulatory molecule B7-1 was constructed by using lentivirus as a vector, and its expression in 293T cells was identified, which laid a foundation for the experimental study of double gene therapy for lymphoma. [methods] 1. In the first part, the full-length encoding sequence cDNA, of mouse MIP-1 偽 and B7-1 genes was synthesized by using self-designed primers. The target gene was amplified by nested PCR, and the lentivirus vector was digested by Age I enzyme. The target gene was directly ligated with the lentivirus vector which was linearized by enzyme digestion, and its product was transformed into E. coli DH5 偽 competent cells. The positive clones were identified by PCR and sequenced directly. The result of sequencing is consistent with the target gene sequence, that is, the successful construction of the target gene plasmid. Then the constructed target gene plasmid was extracted by ultrapure endotoxin removal. 2. In the second part, MIP-1 偽 and B7-1 target gene plasmids were transfected into 293T cells respectively. After 48 hours, the expression of green fluorescent protein (GFP) of fluorescent reporter gene was observed, and the expression of the target gene plasmid in 293T cells was detected by Western Blot method. 3. In the third part, pGC-LV recombinant lentivirus vector, packaging plasmid pHelper 1.0 vector and pHelper 2.0 vector were used to co-transfect 293T cells. After 48 hours of culture, supernatants containing lentivirus particles were collected. Concentrated and purified lentivirus concentrate with high titer was obtained. 10 渭 l lentivirus concentrate was transfected into 293T cells, and total RNA, was extracted by reverse transcription to obtain cDNA,. The titer of lentivirus concentrate was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. [result] 1. The recombinant lentivirus vector of mouse chemokine MIP-1 偽 and costimulatory molecule B7-1 was successfully constructed. 2. After transfection of MIP-1 偽 and B7-1 target gene plasmids into 293T cells, the expression of MIP-1 偽 and B7-1 target gene plasmids in 293T cells were successfully detected by, Western Blot. 3. The three plasmids were successfully cotransfected into 293T cells and packaged with high titer of MIP-1 偽 and B7-1 recombinant lentivirus concentrate. Real-time quantitative PCR confirmed that MIP-1 偽 and B7-1 recombinant lentivirus vectors all had the titer of 2.00E8 TU/ml.. [conclusion] the recombinant lentivirus vector with high titer of mouse chemokine MIP-1 偽 and costimulatory molecule B7-1 was successfully constructed and packaged in this study, which laid a foundation for the experimental study of double gene therapy for lymphoma.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

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本文編號：2407910