發(fā)布時間：2019-01-10 07:04

【摘要】：目的構(gòu)建穩(wěn)定高表達芳香烴受體(AhR)的小鼠RAW264.7細胞株,觀察AhR對脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7細胞炎癥細胞因子表達的影響。方法構(gòu)建含AhR-Flag-EGFP基因的慢病毒重組質(zhì)粒載體并獲得病毒上清,感染RAW264.7細胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達的單克隆細胞株,通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白表達情況,qRT-PCR和Western blot法驗證AhR基因及蛋白水平表達情況。qRT-PCR和ELISA檢測LPS刺激后炎癥細胞因子的表達情況。結(jié)果獲得1株穩(wěn)定高表達AhR的RAW264.7細胞,熒光顯微鏡和流式細胞儀顯示其熒光率達100%,qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明RAW/AhR穩(wěn)轉(zhuǎn)組相對于RAW/Vector空轉(zhuǎn)組,AhR的m RNA和蛋白水平明顯上調(diào)(P0.05)。LPS刺激后炎癥相關(guān)細胞因子表達升高,相對于空轉(zhuǎn)組,穩(wěn)轉(zhuǎn)組的促炎細胞因子IL-6、IL-1β的表達更低(P0.05),抗炎細胞因子IL-10的表達更高(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建穩(wěn)定表達AhR的RAW264.7單克隆細胞株,證實了AhR對LPS刺激的巨噬細胞炎癥反應(yīng)具有負性調(diào)控作用,為后續(xù)進一步研究巨噬細胞中AhR的免疫調(diào)節(jié)及其他功能奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct a mouse RAW264.7 cell line with high expression of aromatics receptor (AhR) and observe the effect of AhR on the expression of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Methods Lentivirus recombinant plasmid vector containing AhR-Flag-EGFP gene was constructed and virus supernatant was obtained. After infection with RAW264.7 cells, stable expression monoclonal cell lines were obtained by purine mycin screening. The expression of green fluorescent protein was detected by fluorescence microscope and flow cytometry, the expression of AhR gene and protein was confirmed by qRT-PCR and Western blot, and the expression of inflammatory cytokines after LPS stimulation was detected by qRT-PCR and ELISA. Results A stable RAW264.7 cell line with high expression of AhR was obtained. Fluorescence microscopy and flow cytometry showed that the fluorescence rate of RAW264.7 cells was 100%. The results of RT-PCR and Western blot showed that the stable transformation group of RAW/AhR was relative to the empty group of RAW/Vector. The level of m RNA and protein of AhR was significantly up-regulated (P0.05). The expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6,IL-1 尾) in stable group was lower than that in control group (P0.05). The expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 was higher (P0.05). Conclusion the successful construction of RAW264.7 monoclonal cell lines stably expressing AhR has proved that AhR has a negative regulatory effect on the inflammatory response of macrophages stimulated by LPS, which lays a foundation for further study on the immunomodulation and other functions of AhR in macrophages.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第一研究室;重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科;
【基金】：國家自然科學(xué)基金項目(81671906) 第三軍醫(yī)大學(xué)成果轉(zhuǎn)化基金項目(2016XZH11) 創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室開放課題(SKLKF201601)
【分類號】：R392

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本文編號：2406027