發(fā)布時(shí)間：2019-01-09 05:49

【摘要】：研究背景： 肝衰竭具有病情危重、預(yù)后差、病死率極高、治療難度大的特點(diǎn)。人工肝支持療法已被證實(shí)是一種能夠暫時(shí)替代患肝的部分功能,為其肝細(xì)胞再生爭(zhēng)取時(shí)間,使患者得以過渡到自體肝功能恢復(fù)或肝移植的有效手段。人工肝支持療法自上世紀(jì)50年代始,從非生物型發(fā)展至今,已經(jīng)進(jìn)入到生物型、混合型的攻堅(jiān)階段。 生物型/混合型人工肝得以起效,需要極大量(大于5×109)的具有良好活性和肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。選擇適合用于人工肝支持系統(tǒng)的細(xì)胞源,是生物型/混合型人工肝的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前國際上研究較多的細(xì)胞源包括：成熟的人肝或豬肝細(xì)胞、人肝腫瘤的細(xì)胞系(如C3A等)、胎肝細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞株(如本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HepLL、HepLi4),以及各種類型的干細(xì)胞。雖然細(xì)胞材料繁多,但目前尚無一種細(xì)胞源能完全滿足生物人工肝應(yīng)用的需要。 肝祖細(xì)胞是肝臟來源的干細(xì)胞,同時(shí)具有肝細(xì)胞與膽管細(xì)胞的表型,自我復(fù)制能力強(qiáng),有向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞雙向分化的潛能,且在發(fā)育學(xué)上與肝外來源的干細(xì)胞相比,具有更接近成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。因此,這類細(xì)胞被認(rèn)為是一種很有前景的用于肝病治療的細(xì)胞源。但是,肝祖細(xì)胞要作為生物人工肝的細(xì)胞源應(yīng)用于臨床,還有許多問題亟須解決。其中,進(jìn)一步明確影響肝祖細(xì)胞增殖和分化的因素,建立起安全高效的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化體系,是肝祖細(xì)胞得以更深入研究和廣泛應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。 第一部分膠原蛋白應(yīng)用于肝祖細(xì)胞的無血清培養(yǎng)的研究 目的：本研究旨在應(yīng)用膠原蛋白披覆的平板和無血清培養(yǎng)基相結(jié)合的方法優(yōu)化肝祖細(xì)胞的無血清培養(yǎng),以建立更安全的肝祖細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。 方法：以源自TAT啟動(dòng)子-lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的具有雙向分化潛能的肝祖細(xì)胞系BMEL-TAT為肝祖細(xì)胞模型,以不同種類膠原蛋白披覆的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)平板和一種無血清培養(yǎng)基相結(jié)合的方式,連續(xù)培養(yǎng)肝祖細(xì)胞14天。選用的膠原蛋白包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(質(zhì)量比1：1),以及Ⅳ型膠原蛋白。以無膠原披覆的細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)合同種無血清培養(yǎng)基,或結(jié)合添加了5%胎牛血清的同種培養(yǎng)基組,分別作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。動(dòng)態(tài)觀測(cè)BMEL-TAT細(xì)胞在不同條件下的形態(tài)(倒置相差顯微鏡)、貼壁、增殖(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法、Cellscreen法)和向肝細(xì)胞方向自分化(X-gal染色、MUG檢測(cè))的程度。 結(jié)果：BMEL-TAT細(xì)胞在所測(cè)試的膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時(shí),均呈單層貼壁生長,與含血清培養(yǎng)組的生長模式相似,但其在無膠原的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時(shí),呈聚集生長模式。在所測(cè)試的膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時(shí)BMEL-TAT的貼壁速率、效率和增殖速率均高于普通培養(yǎng)板無血清組,其增殖速率與含血清培養(yǎng)組無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。X-gal染色和MUG檢測(cè)的結(jié)果基本一致,均提示在各種膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)的BMEL-TAT顯示出與含血清培養(yǎng)組相當(dāng)?shù)南蚋渭?xì)胞方向的自分化水平,但其自分化水平低于在普通培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)的BMEL-TAT自分化水平。膠原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合,以及Ⅳ型能等效地促進(jìn)BMEL-TAT細(xì)胞的貼壁和增殖,對(duì)其生長模式和向肝細(xì)胞自分化的影響亦相當(dāng)。 結(jié)論：選用膠原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(質(zhì)量比1：1),以及Ⅳ型中的任何一種披覆細(xì)胞培養(yǎng)板,均能使BMEL-TAT細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)與常規(guī)含5%胎牛血清培養(yǎng)等效的生長、增殖和向肝細(xì)胞自分化的水平。 第二部分海藻酸-殼聚糖微囊包裹法應(yīng)用于肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的研究 目的：本研究旨在評(píng)價(jià)海藻酸-殼聚糖微囊包裹技術(shù)應(yīng)用于肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的可行性和有效性,以建立高效的便于放大規(guī)模的誘導(dǎo)分化體系,為肝祖細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于微囊相關(guān)的生物反應(yīng)器為核心的生物人工肝提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 方法：以源自TAT啟動(dòng)子-lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的具有雙向分化潛能的肝祖細(xì)胞系BMEL-TAT為細(xì)胞模型,以海藻酸-殼聚糖微囊包裹5×106/ml和2×106/ml兩種BMEL-TAT細(xì)胞密度。微囊包裹后在生長培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)21天,動(dòng)態(tài)觀測(cè)微囊內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)(倒置光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡)、活力(FDA/PI雙染色)和增殖(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)),以及微囊的機(jī)械強(qiáng)度�；蚴俏⒛野笙扔蒙L培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后,再換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)15天,動(dòng)態(tài)觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)(倒置光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡)、活力(FDA/PI雙染色)和向肝細(xì)胞方向分化的程度(熒光定量PCR檢測(cè)ALB、TAT、CK19和GGT IV基因的表達(dá),尿素合成功能檢測(cè))。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)以單層貼壁的BMEL-TAT作為對(duì)照。 結(jié)果：兩微囊組在生長培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)21天的過程中,包裹BMEL-TAT的海藻酸-殼聚糖微囊具有良好的機(jī)械性能,微囊內(nèi)BMEL-TAT細(xì)胞漸呈聚集生長趨勢(shì),細(xì)胞聚集體形成的時(shí)間、數(shù)目和大小與包裹的細(xì)胞密度密切相關(guān)。微囊內(nèi)細(xì)胞具有良好活力,但增殖不明顯。 兩微囊組在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后,換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)15天的過程中,海藻酸-殼聚糖微囊內(nèi)BMEL-TAT細(xì)胞呈聚集生長趨勢(shì),具有良好活力。熒光定量PCR結(jié)果顯示海藻酸-殼聚糖微囊包裹的細(xì)胞密度高(5×106/ml)時(shí),BMEL-TAT顯示出更好的向肝細(xì)胞的分化。細(xì)胞包裹密度5×106/ml的海藻酸殼聚糖微囊組與單層貼壁組相比,BMEL-TAT細(xì)胞中成熟肝細(xì)胞相關(guān)基因(ALB、TAT)的上調(diào),以及肝祖細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞相關(guān)基因(CK19)的下調(diào)均更顯著(P0.05)。兩微囊組BMEL-TAT細(xì)胞的尿素合成量均在誘導(dǎo)前5天緩慢上升,而后迅速上升至誘導(dǎo)第10天出現(xiàn)高峰,隨后有所回落。5×106/ml細(xì)胞密度微囊組BMEL-TAT的尿素合成量高于2×106/ml細(xì)胞密度微囊組,而2×106/ml細(xì)胞密度微囊組又高于單層貼壁組,其中5×106/ml密度微囊組的尿素合成高峰值是單層貼壁組高峰值的2.44倍,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。熒光定量PCR和尿素合成檢測(cè)的結(jié)果均提示細(xì)胞包裹密度5×106/ml的海藻酸-殼聚糖微囊能顯著促進(jìn)BMEL-TAT向肝細(xì)胞方向的分化。 結(jié)論：海藻酸-殼聚糖微囊包裹能促進(jìn)BMEL-TAT細(xì)胞向肝細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化,微囊包裹的細(xì)胞密度以5×106/ml為宜。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2405215