【摘要】：目的探索結(jié)核分枝桿菌Rv1272和Rv1273基因編碼蛋白與藥物外排的關(guān)系及研究其物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能,為探討結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制提供實驗支持。 方法利用生物信息學(xué)方法分析Rv1272和Rv1273基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu),采用PCR技術(shù)擴(kuò)增這兩個基因,并與pMF406質(zhì)粒連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,測序正確后,電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌mc2155。同時用pMF406空質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入mc2155做對照。對這兩個蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位后,用試管法測定其對常用的九種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。另一方面,用530nm激發(fā)光和590nm散射光,顯示菌體對溴化乙錠(Ethidium bromide, EB)吸收的量,判斷這兩個基因是內(nèi)排還是外排EB。然后構(gòu)建菌株pMF-△Rv1273,進(jìn)一步驗證這兩個基因的功能。最后通過檢測菌株生長對EB的敏感性,進(jìn)一步驗證其功能。 結(jié)果經(jīng)驗證Rv1272和Rv1273為膜蛋白。通過測定發(fā)現(xiàn)與對照菌株相比,含有這兩個基因的重組菌株對所測藥物的MIC無顯著性差異,未發(fā)現(xiàn)膜蛋白Rv1272和Rv1273在重組菌株中對所測藥物的外排作用。與對照菌株相比,菌株pMF406-Rv1272對EB的吸收沒有顯著變化。而菌株pMF406-Rv1273 EB的吸收量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照菌株,菌株pMF-△Rv1273與對照菌株EB吸收量基本接近。在大腸桿菌和恥垢分枝桿菌中,含有Rv1272和Rv1273重組質(zhì)粒的菌株與對照菌株相比,菌體生長均受到抑制。 結(jié)論Rv1272和Rv1273蛋白為膜蛋白,未發(fā)現(xiàn)其與結(jié)核分枝桿菌耐藥之間的直接關(guān)系。Rv1272蛋白可能沒有物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能,而Rv1273蛋白可能是一個向內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵,而且其轉(zhuǎn)運依賴ATP的水解供能。
[Abstract]:Objective to explore the relationship between Rv1272 and Rv1273 gene coding protein and drug efflux of Mycobacterium tuberculosis and to study its substance transport function in order to provide experimental support for exploring the molecular mechanism of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis. Methods the structures of Rv1272 and Rv1273 genes and their encoded proteins were analyzed by bioinformatics method. The two genes were amplified by PCR technique. The recombinant plasmids were constructed by ligation with pMF406 plasmids. Electroporation of Recombinant plasmid into Mycobacterium mc2155. At the same time, pMF406 empty plasmids were electrotransferred into mc2155 as control. After subcellular localization of the two proteins, the minimum inhibitory concentration (minimal inhibitory concentration, MIC).) of the two proteins against nine commonly used antimicrobial agents was determined by test tube method. On the other hand, 530nm excitation light and 590nm scattering light were used to show the amount of ethidium bromide (Ethidium bromide, EB) absorbed by the cell, and to determine whether the two genes were internal or external efflux EB.. The function of the two genes was further verified by constructing the strain pMF- Rv1273,. Finally, the sensitivity of strain growth to EB was tested to further verify its function. Results Rv1272 and Rv1273 were confirmed as membrane proteins. Compared with the control strains, the recombinant strains containing these two genes had no significant difference in the MIC of the drugs tested, and the efflux of the membrane proteins Rv1272 and Rv1273 to the tested drugs in the recombinant strains was not found. Compared with the control strain, the absorption of EB by strain pMF406-Rv1272 had no significant change. The absorption of pMF406-Rv1273 EB was much higher than that of the control strain, and the absorption of pMF- Rv1273 was similar to that of the control strain EB. In Escherichia coli and Mycobacterium smegmatis, the growth of the strains containing recombinant plasmids of Rv1272 and Rv1273 were inhibited compared with the control strains. Conclusion Rv1272 and Rv1273 proteins are membrane proteins, and there is no direct relationship between them and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis. Rv1272 protein may have no substance transport function, while Rv1273 protein may be a substance transport pump. Moreover, its transport depends on the hydrolytic energy supply of ATP.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378.911

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本文編號：2401545