【摘要】：目的：樹突狀細胞（dendritic cells,DC）是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的唯一能夠刺激初始T細胞的活化增殖和功能最強大的抗原提呈細胞（antigenpresenting cell,APC），其可介導(dǎo)抗原轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)激活靜息T細胞，啟動特異性免疫應(yīng)答。多發(fā)性硬化（muitiple sclerosis,MS）是主要以T細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性脫髓鞘疾病，它的發(fā)病機制雖然仍未得到完全明確，但眾多研究表明，MS的發(fā)生與T細胞異�；罨嘘P(guān)，并且，MS的病理免疫應(yīng)答與DC的參與有直接關(guān)系�；贒C的特性，近年來，將DC用于自身免疫性疾病的研究已得到深入開展，特別是將其應(yīng)用于多發(fā)性硬化的治療已成為目前的研究熱點。因此，能夠正確、高效的分離培養(yǎng)出DC并對其進行鑒定是運用DC開展下游實驗的基礎(chǔ)與前提。 我們設(shè)計了本實驗，旨在用rmGM-CSF、rmIL-4及TNF-α在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓源成熟樹突狀細胞與免疫磁珠分離純化相結(jié)合的方法獲得DC并對DC從形態(tài)學(xué)觀察、細胞表面分子的檢測及刺激T細胞增值能力三方面進行鑒定，探討及優(yōu)化小鼠骨髓源成熟樹突狀細胞的分離培養(yǎng)、純化及鑒定方法，為進一步研究DC在多發(fā)性硬化治療方法中的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。 方法: 1.骨髓源性成熟DC的分離及培養(yǎng) 將Ｃ57BL/6小鼠用拉頸法處死后浸泡在75%乙醇中3-5分鐘，無菌取出下肢骨，用注射器針頭在長骨兩端扎眼使髓腔聯(lián)通，用注射器吸少量RPMI-1640培養(yǎng)液將骨髓沖出，用200目濾網(wǎng)過濾后加入紅細胞裂解液溶解紅細胞，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞，然后用RPMI1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、rmGM-CSF（10ng/ml）、rmIL-4(10ng/ml)）調(diào)整細胞濃度至106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中，將細胞培養(yǎng)板放入37oC、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第6天加入rmTNF-α(15ng/ml)至細胞培養(yǎng)板中并繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天收集細胞培養(yǎng)板中所有的懸浮細胞，此即為小鼠骨髓源性的成熟DC。 2．CD11c免疫磁珠分離純化DC： 2.1使用CD11c免疫磁珠標記DC：對DC進行計數(shù)，重懸于緩沖液中。加入CD11c免疫磁珠，于2--8oC孵育15分鐘后重懸于緩沖液中。 2.2使用磁珠分選器分離DC：將LS柱放置在MiDi MACS磁珠分選器中，加入適量緩沖液潤洗LS柱。將磁珠標記的細胞懸液放入分選柱中，收集流出物，這是未標記的陰性細胞。將分選柱從分選器上移下，加入5ml緩沖液，用配套活塞將標記細胞推出來，，此即為純化后的成熟DC。 3.小鼠骨髓源成熟樹突狀細胞的鑒定 3.1細胞形態(tài)學(xué)觀察 3.1.1在倒置熒光顯微鏡下對DC形態(tài)進行觀察。 3.1.2掃描電鏡對DC形態(tài)進行觀察并拍照。 3.1.3透射電鏡觀察并拍照。 3.2流式細胞儀檢測細胞表面分子：收集細胞培養(yǎng)板中的懸浮細胞，經(jīng)離心、洗滌、計數(shù)、定容、標記后分別加入抗體，室溫避光孵育20分鐘后離心、洗滌后使用流式細胞儀檢測DC表面CD11c、CD80、CD86、MHCII分子的表達情況。 3.3采用細胞增殖檢測試劑（CCK-8）法測定單向混合淋巴細胞反應(yīng)（one-way MLR）中的DC對同種異基因T細胞刺激增殖的能力：（1）�。�57BL/6小鼠骨髓中的成熟DC作為刺激細胞，方法同前。（2）提取BALB/c小鼠脾臟中的T細胞作為反應(yīng)細胞，并取部分T細胞做分選前流式檢測（3）采用CD90免疫磁珠分離純化T細胞。（4）流式細胞儀檢測T細胞純度。（5）DC與T細胞共培養(yǎng)：DC與T細胞的比例分別設(shè)定為1：5、1:10、1:20、1:40，共培養(yǎng)72小時，于培養(yǎng)結(jié)束前4小時加入CCK-8，每孔20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時并于加入CCK-8后的第2、3、4小時分別上酶聯(lián)檢測儀檢測一次，記錄吸光度值。 結(jié)果: 1.成熟DC的形態(tài)觀察 1.1倒置熒光顯微鏡觀察：小鼠骨髓細胞經(jīng)GM-CSF、rmIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時可見大部分細胞貼壁生長，細胞形態(tài)大小不等，培養(yǎng)72小時后懸浮細胞較前增多，部分細胞形成集落。培養(yǎng)第6天可見懸浮細胞繼續(xù)增多，并可見少量樹突樣突起。加入rmTNF-α培養(yǎng)24小時后細胞表面出現(xiàn)典型的樹枝樣突起，完全符合典型成熟DC的形態(tài)。 1.2掃描電鏡下觀察：DC形態(tài)多樣，結(jié)構(gòu)完整，表面粗糙，好似覆蓋著一層薄紗，細胞表面粗糙，有大量褶皺及樹枝樣突起，符合典型的成熟DC的形態(tài)。 1.3透射電鏡觀察：DC胞體較大，形狀不規(guī)則，細胞表面有較長的樹枝狀突起，長短不一，粗細不均；胞核形態(tài)多樣，可見清晰的核膜；胞漿內(nèi)細胞器豐富，可見大量的高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及核糖體，但囊泡狀結(jié)構(gòu)及溶酶體減少。 2.流式細胞儀檢測DC表面分子：小鼠骨髓源成熟樹突狀細胞高表達CD11c，純度大于90%。細胞表面CD80（94.73%±1.45%）、CD86（96.43%±2.00%）、MHCII（94.13%±5.86%），均呈高表達，符合成熟DC的表達特征。 3.DC刺激同種異基因T細胞增殖的能力：磁珠分選后的小鼠T細胞經(jīng)流式檢測其純度大于90%，各小時組、各DC：T細胞比例的刺激指數(shù)均能說明DC有刺激同種異基因T細胞增殖的能力，但在加入CCK-8后的第2、3小時分別檢測其各相鄰DC：T細胞比例的刺激指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異；第4小時DC刺激T細胞增殖的能力與DC所占比例呈正比，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論: 1.本實驗利用GM-CSF、IL-4及TNF-α體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與免疫磁珠分離提純相結(jié)合的方法成功培養(yǎng)并擴增出高純度的成熟DC，利用此方法培養(yǎng)出來的成熟DC具有典型的樹突狀形態(tài)，數(shù)量大，純度高。 2.通過形態(tài)學(xué)觀察、細胞表面因子流式學(xué)檢測及單向混合淋巴細胞反應(yīng)三方面對細胞進行了鑒定，證明其為成熟的DC。在測定單向混合淋巴細胞反應(yīng)中DC對T細胞刺激增殖能力時，我們用CCK-8法替代了傳統(tǒng)的MTT法，使得實驗結(jié)果更加穩(wěn)定、可靠，實驗結(jié)果還證明利用CCK-8法最佳測定時間是在加入CCK-84小時后，且DC刺激T細胞增殖的能力與DC所占比例成正比。 3.本實驗對小鼠骨髓源成熟樹突狀細胞的體外分離培養(yǎng)、純化及鑒定進行了探討，為研究DC的功能及其在多發(fā)性硬化等免疫疾病治療中的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2400455