【摘要】：背景與目的：睪丸是典型的免疫豁免組織,卻能有效的清除感染的病原體,睪丸細(xì)胞的天然免疫防御功能長(zhǎng)期受到研究者的關(guān)注,其調(diào)節(jié)機(jī)理有待進(jìn)一步揭示。Toll樣受體(TLR)可以啟動(dòng)睪丸體細(xì)胞的天然免疫反應(yīng),然而在生精細(xì)胞中的表達(dá)和功能尚未做深入研究。本論文旨在系統(tǒng)研究TLR3在生精細(xì)胞中的表達(dá)和功能。 材料與方法：分離止常C57BL/6小鼠各期生精細(xì)胞,使用其標(biāo)記基因,包括精原細(xì)胞的標(biāo)記基因Kit,精母細(xì)胞的標(biāo)記基因聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白(synaptonemal complex protein2,Scp2),精子細(xì)胞的標(biāo)記基因魚精蛋白2(protamin2, Prm2);通過(guò)real-time RT-PCR,免疫組化及Western blotting技術(shù)分別在mRNA及蛋白水平上檢測(cè)TLR3在生精細(xì)胞中的表達(dá)；利用poly(I:C)激活生精細(xì)胞中的TLR3研究其在生精細(xì)胞中的功能及信號(hào)通路。吖啶橙／溴化乙錠(AO/EB)混合染色,TUNEL染色及流式細(xì)胞儀分析生精細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)小鼠生精細(xì)胞組成性的表達(dá)TLR3,主要定位于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞,poly(I:C)可誘導(dǎo)精原和精母細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子(包括IL-1p,IL-6和TNF-a),1型干擾素(IFNa, IFNβ)及抗病毒蛋白(OAS1, PKR, MX1),這種作用依賴于NF-κB和IRF-3的激活。另外TLR3的激活還可以誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡,這種作用可能是通過(guò)上調(diào)TNF-α實(shí)現(xiàn)的。體外實(shí)驗(yàn)證明TNF-α表現(xiàn)出雙重功能：低濃度的TNF-α可以抑制生精細(xì)胞的凋亡,而高濃度的TNF-α可以促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡。 結(jié)論：TLR3表達(dá)于精原與精母細(xì)胞,生精細(xì)胞中TLR3的激活可以行使兩方面的功能：一方面啟動(dòng)生精細(xì)胞抗病毒的天然免疫反應(yīng),另一方面可以誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡。為病毒感染干擾精子發(fā)生的機(jī)理提供了新的線索。
[Abstract]:Background & objective: testis are typical immune exempted tissues, but they can effectively remove the infected pathogens. The innate immune defense function of testicular cells has been concerned by researchers for a long time. Toll like receptor (TLR) can initiate the innate immune response of somatic cells in testis, but its expression and function in spermatogenic cells have not been further studied. The purpose of this thesis is to study the expression and function of TLR3 in spermatogenic cells. Materials and methods: spermatogenic cells of normal C57BL/6 mice were isolated and labeled with their marker genes, including the marker gene of spermatogonial Kit, (synaptonemal complex protein2,Scp2. Sperm cell labeled gene protamine 2 (protamin2, Prm2); The expression of TLR3 in spermatogenic cells was detected by real-time RT-PCR, immunohistochemistry and Western blotting technique at the level of mRNA and protein respectively. Poly (I: C) was used to activate TLR3 in spermatogenic cells to study its function and signal pathway in spermatogenic cells. Acridine orange / ethidium bromide (AO/EB) mixed staining, TUNEL staining and flow cytometry were used to analyze the apoptosis of spermatogenic cells. Results: the constitutive expression of TLR3, in mouse spermatogenic cells was mainly localized in spermatogonia and spermatocyte, poly (I: C), which could induce the production of many inflammatory factors (including IL-1p,IL-6 and TNF-a) in spermatogonial and spermatogenic cells. Type 1 interferon (IFNa, IFN 尾) and antiviral protein (OAS1, PKR, MX1), which depends on the activation of NF- 魏 B and IRF-3. In addition, the activation of TLR3 can also induce the apoptosis of spermatogenic cells, which may be achieved by upregulating TNF- 偽. In vitro experiments showed that TNF- 偽 had dual functions: low concentration of TNF- 偽 could inhibit the apoptosis of spermatogenic cells, while high concentration of TNF- 偽 could promote the apoptosis of spermatogenic cells. Conclusion: TLR3 is expressed in spermatogonial and spermatogenic cells. The activation of TLR3 in spermatogenic cells can perform two functions: on the one hand, it can activate the innate immune response of spermatogenic cells against virus, on the other hand, it can induce the apoptosis of spermatogenic cells. It provides a new clue for virus infection to interfere the mechanism of spermatogenesis.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R321

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